转录本组装与新转录本鉴定（StringTie）
转录本组装是把 RNA-seq reads 拼接成完整的转录本结构，用来发现参考注释中没有的新异构体、新基因和新 lncRNA，或为注释不完整的物种补充转录组。有参考基因组时，常用 StringTie 在剪接感知比对（HISAT2、STAR）结果上做参考引导组装：各样本分别组装后，用 stringtie --merge 合并为统一注释，再用 gffcompare 与参考比较，按类别码区分已知转录本、新异构体、基因间新转录本等。没有参考基因组时用 Trinity 等从头组装工具。长读长测序可以直接读出全长转录本，组装和分类方法有所不同，常与短读长组合使用。
什么时候用
- 物种注释不完整，需要基于 RNA-seq 补充基因结构
- 寻找疾病或处理条件下出现的新异构体和新剪接方式
- 作为 lncRNA 鉴定的前置步骤，得到候选新转录本
- 在肿瘤中发现新外显子、基因间新转录单元等异常转录本
- 用长读长转录组构建全长异构体参考，再定量短读长数据
不适合的情况
- 只做已知基因的差异表达，组装会增加计算量并引入噪音
- 3' 端单细胞或 3' 标签测序数据，reads 不覆盖全长，无法组装结构
- 测序深度很低或读长很短的数据，低表达转录本的结构会大量出错
需要准备的数据
- 排序后的 BAM
- 剪接感知比对结果，按坐标排序；HISAT2 可加 --dta 输出更适合组装的比对
- 参考基因组与注释 GTF
- 参考引导组装需要 GTF，版本应与比对时一致，染色体命名要统一
- 文库链方向
- 链特异性方向需在组装时指定，设置错误会影响正反义转录本判断
- 长读长数据（可选）
- PacBio Iso-Seq 或 Nanopore cDNA，可为短读长组装提供全长结构证据
分析步骤
- 1
剪接感知比对
用 HISAT2 或 STAR 比对，组装前检查剪接 reads 比例和链方向。HISAT2 的 --dta 会要求剪接比对有更长的锚定序列，减少由短锚定产生的假剪接位点。
- 2
单样本组装
对每个样本运行 StringTie，用 -G 提供参考 GTF 作引导，并按文库方向设置 --rf 或 --fr。输出 GTF 中包含每个转录本的覆盖度以及 FPKM、TPM 估计。
- 3
合并组装结果
用 stringtie --merge 结合参考 GTF 合并所有样本的转录本，得到统一的非冗余集合。合并时可设最小覆盖、最小 TPM 和最小异构体比例，去掉只在个别样本中出现的低表达转录本。
- 4
与参考比较
用 gffcompare 将合并结果与参考注释比较，得到每个转录本的类别码和整体灵敏度、精确度。已知转录本的匹配比例可以作为组装质量的参照。
- 5
筛选新转录本
按类别码挑选新异构体（j）、基因间新转录本（u）、反义转录本（x）等，再结合长度、外显子数、跨样本检出情况和剪接位点的 junction reads 支持进行过滤。
- 6
重新定量
用 StringTie -e -B 基于合并 GTF 重新估计每个样本的表达，并用 prepDE.py 生成计数矩阵供 DESeq2 等分析；也可用合并注释提取转录本序列构建 Salmon 索引定量。
- 7
功能评估
对新转录本预测 ORF 和编码潜能，检查新异构体是否改变或截断已知蛋白结构域，并在基因组浏览器中核对覆盖和剪接 reads 支持。
关键参数与决策
链方向（--rf / --fr）
必须与文库类型一致，dUTP 法建库通常对应 --rf。设置错误会把转录本组装到错误的链上，gffcompare 中反义类别的转录本会异常增多。
最小异构体比例（-f）
低于同位点最高表达异构体该比例的异构体会被丢弃，默认值为 0.01。提高该值能减少低丰度假异构体，但会漏掉表达较低的真实异构体。
最小转录本长度（-m）
默认 200 nt，与 lncRNA 的长度定义一致。研究短转录本时可以下调，但短片段中组装噪音的比例会上升，需要更严格的表达过滤。
合并过滤阈值
--merge 时的最小 TPM、FPKM 和覆盖度决定最终新转录本的数量。阈值过低会把单样本偶发转录本纳入，建议同时要求在多个样本中检出。
仅定量模式（-e）
加 -e 时 StringTie 只对给定 GTF 定量，不再组装新结构，适合合并后的二次定量；第一轮组装不能使用，否则发现不了新转录本。
常见错误
- 链方向设错：转录本被组装到错误方向，gffcompare 中大量转录本被判为反义，新转录本列表基本不可用。
- 各样本组装后不合并就比较：每个样本的转录本 ID 和结构不同，表达无法对齐，必须先合并成统一注释再重新定量。
- 把单外显子新转录本都当作新基因：单外显子转录本常来自基因组 DNA 污染、内含子保留或未成熟 RNA，需要更严格的表达和重复检出要求。
- 用组装输出的 FPKM 直接做差异检验：组装中的表达估计不适合直接做统计检验，应生成计数矩阵后用 DESeq2、edgeR 等计数模型分析。
- 参考 GTF 与基因组版本不一致：染色体命名或坐标不匹配会让参考引导失效，几乎所有转录本都被判为新转录本。
结果怎么看
gffcompare 统计摘要
给出碱基、外显子、内含子、转录本各层面的灵敏度和精确度，以及新外显子、新内含子比例。精确度很低通常说明过滤太松或链方向设错；灵敏度低可能是测序深度不足。
类别码统计图
显示各类别转录本的数量，如完全匹配、新异构体、基因间、反义、内含子内转录本。基因间和内含子内新转录本占比远超新异构体时，往往提示 DNA 污染或未成熟 RNA 较多。
合并 GTF 与转录本表
每个转录本含坐标、外显子数、长度、类别码、最近参考基因和各样本表达。优先关注多样本检出、剪接位点有充足 junction reads 支持的新转录本。
基因结构与覆盖图
把新异构体与参考异构体并排展示，叠加 reads 覆盖和每个剪接点的 junction reads 数。新外显子或新剪接位点缺少 junction reads 支持时，结构可信度低。
新转录本表达与编码潜能
展示新转录本的表达分布和 ORF 预测结果。新异构体如果改变或截断了已知蛋白结构域，可作为功能验证的优先候选。
和相近方法怎么选
StringTie 与 Trinity
StringTie 基于参考基因组比对组装，速度快，适合有参考的物种；Trinity 不需要基因组，直接从 reads 组装，适合无参考物种，但冗余高、资源消耗大，常需去冗余和完整性评估。
短读长组装与长读长全长转录本
短读长组装需从片段推断整体结构，复杂基因的异构体容易拼错；长读长一条 read 覆盖完整转录本，结构更可靠，但通量和定量精度较低。两者常组合使用。
转录本组装与可变剪接分析
rMATS 等可变剪接工具基于注释和 junction reads 比较剪接事件的包含水平，重点是定量比较；组装用于发现新结构。只比较已知剪接事件时，不必先组装。
StringTie 与 Salmon
Salmon 依赖给定的转录组快速估计表达，不能发现新转录本；StringTie 能组装新结构。常见流程是先用 StringTie 组装合并，再用合并注释构建 Salmon 索引定量。
常见问题
HISAT2 为什么要加 --dta
--dta 让 HISAT2 输出更适合下游转录本组装的比对，要求剪接比对有更长的锚定序列，减少短锚定带来的错误剪接位点。这样组装出的转录本碎片和假异构体更少，代价是剪接 reads 数略有下降。
gffcompare 的类别码分别代表什么
类别码描述组装转录本与参考的关系。常见的有：= 表示内含子链与参考完全一致；j 表示与参考共享至少一个剪接位点的新异构体；u 表示基因间未知转录本；x 表示与参考外显子反义重叠；i 表示完全位于参考内含子中。
StringTie 组装出很多新转录本正常吗
原始组装中常有大量低表达新转录本，其中不少是噪音。经过合并时的表达过滤、跨样本检出要求和剪接位点支持筛选后，数量会大幅下降。结果是否合理，可参考已知转录本的匹配比例来判断。
组装之后怎么做差异表达
用合并后的 GTF 对每个样本运行 StringTie -e 重新定量，再用 prepDE.py 生成基因和转录本计数矩阵，交给 DESeq2 或 edgeR。也可以从合并 GTF 提取转录本序列，用 Salmon 定量后汇总到基因。
没有参考基因组怎么组装
可用 Trinity 等从头组装工具直接从 reads 构建转录本，再用 BUSCO 评估完整性，去除冗余后预测 ORF 并做功能注释。从头组装对测序深度和计算资源要求更高，结果中同一基因的碎片化转录本也更多。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 里描述数据和目标后，会确认物种、参考版本、文库链方向和样本分组，读取本地 FASTQ、BAM 或下载公开数据；随后完成剪接感知比对、单样本组装、合并与参考比较、新转录本筛选，以及基于合并注释的重新定量，交付合并后的 GTF、类别码统计、新转录本列表、结构与覆盖图、计数矩阵、分析报告和可复现脚本。
我有某近交系小鼠肝脏 8 个样本的链特异性 RNA-seq，想用 StringTie 组装，找参考注释里没有的新异构体并生成计数矩阵