lncRNA、miRNA 与 circRNA 分析
非编码 RNA 指不翻译成蛋白的 RNA，科研中最常分析三类：长度超过 200 nt 的 lncRNA、约 22 nt 的成熟 miRNA，以及由反向剪接（back-splicing）形成闭合环状结构的 circRNA。三者的建库方式和分析流程差别很大：lncRNA 通常来自去 rRNA 的链特异性 RNA-seq，要经过转录本组装和编码潜能过滤才能鉴定新转录本；miRNA 需要小 RNA 建库，重点是接头去除、长度筛选和与 miRBase 比对；circRNA 依赖跨反向剪接位点（BSJ）的 reads 识别，最好有 RNase R 处理数据佐证。下游常见的是差异表达、靶基因预测、共表达或 ceRNA 网络构建。
什么时候用
- 在已有 RNA-seq 中鉴定新的 lncRNA，并与已知注释区分
- 小 RNA 测序数据定量已知 miRNA、预测新 miRNA 并做差异分析
- 用去 rRNA 的总 RNA-seq 识别 circRNA 并比较组间丰度
- 为差异 miRNA 预测靶基因，并与 mRNA 表达做负相关筛选
- 寻找与表型相关的 lncRNA，通过邻近基因或共表达推测功能
不适合的情况
- 用 polyA 富集文库找 circRNA，环状分子没有 polyA 尾，检出量会严重偏低
- 只凭预测的 ceRNA 网络下调控结论，需要表达定量和实验验证支撑
- 用常规 RNA-seq 定量成熟 miRNA，建库片段选择会丢失绝大多数小 RNA
需要准备的数据
- 链特异性总 RNA-seq FASTQ
- 用于 lncRNA 和 circRNA，建议去 rRNA 建库、双端测序，读长足以跨越剪接位点
- 小 RNA 测序 FASTQ
- 用于 miRNA，需要知道 3' 接头序列和 UMI 结构，单端 50 bp 通常足够
- 参考基因组与注释
- 与样本物种一致的 FASTA 和 GTF，lncRNA 分析建议用 GENCODE 等注释较全的版本
- miRNA 数据库与样本信息
- miRBase 前体与成熟序列；样本分组、批次和建库批号
分析步骤
- 1
质控与预处理
总 RNA-seq 去接头和低质量碱基；小 RNA 数据先去 3' 接头，再保留约 18–30 nt 的 reads。看长度分布，miRNA 文库应在 21–23 nt 出现明显主峰，若峰在 30 nt 以上，提示降解或 tRNA、rRNA 片段污染多。
- 2
比对与 RNA 分类
总 RNA-seq 用 HISAT2 或 STAR 做剪接感知比对；小 RNA reads 用 Bowtie 等短序列比对工具，依次注释到 miRNA、tRNA、rRNA、snoRNA 等类别。各类 RNA 的占比是判断小 RNA 文库质量最直接的指标。
- 3
lncRNA 鉴定
用 StringTie 组装并与参考注释比较，保留长度不少于 200 nt、通常为多外显子、表达达到阈值的新转录本，再用 CPC2、CPAT、PLEK 等评估编码潜能，并检索 Pfam 结构域，排除可能编码蛋白的序列。
- 4
miRNA 定量与新 miRNA
已知 miRNA 可用 miRDeep2 的 quantifier 模块统计 reads；新 miRNA 依据前体能否形成稳定发夹、成熟链和 star 链的 reads 分布是否符合 Dicer 切割模式来判断，miRDeep2 会给出每个候选的打分。
- 5
circRNA 识别
用 CIRI2、CIRCexplorer2、find_circ 等寻找反向剪接 reads，建议取两种工具的交集降低假阳性。按 BSJ reads 数过滤，并计算 circRNA 与同源线性转录本的比例，判断成环信号是否只是宿主基因高表达的副产物。
- 6
差异表达分析
用原始计数矩阵做 DESeq2 或 edgeR 分析。lncRNA 和 circRNA 普遍低表达，先过滤在多数样本中计数极低的特征；miRNA 文库有效 reads 差异大时，要检查标准化后各样本的表达分布是否对齐。
- 7
靶标预测与功能推断
miRNA 靶基因结合 TargetScan、miRDB 等预测库和 miRTarBase 实验验证库；lncRNA 通过顺式邻近基因和反式共表达推断功能；circRNA 可预测 miRNA 结合位点，再结合表达负相关构建 ceRNA 网络。
关键参数与决策
编码潜能判定
不同工具判定标准不同，常用做法是多个工具都判为非编码才保留。非人、非小鼠物种使用 CPAT 时，需要用该物种已知编码和非编码序列重新训练并确定阈值，否则判定不可靠。
新 lncRNA 表达过滤
单外显子转录本中假阳性比例高，常要求多外显子；表达阈值太低会引入组装噪音，太高会丢掉组织特异的低表达 lncRNA，建议结合在重复样本中的检出一致性来定。
miRNA reads 长度窗口
成熟 miRNA 主要集中在 20–24 nt。窗口放得太宽会把 tRNA 片段和降解片段计入，太窄会丢掉长度变异的 isomiR；研究 isomiR 时需保留长度和末端变异信息。
circRNA BSJ 最低 reads 数
常用至少 2 条跨反向剪接位点的 reads 作为检出标准。测序深度低时宁可提高阈值并要求多工具一致，避免把比对错误或基因组重复造成的假嵌合当成环状 RNA。
链特异性方向
比对、组装和定量时要正确指定文库方向，否则反义 lncRNA 会被分配到正义基因上，表现为大量反义转录本表达异常偏高或与宿主基因完全同步。
常见错误
- 把单个样本中检出的新转录本直接当作新 lncRNA：低表达的单外显子片段多为组装噪音或未成熟前体，至少要在重复样本中稳定出现。
- miRNA 用 RPM 后直接做 t 检验：小 RNA 文库组成受降解和 rRNA 污染影响大，应使用原始计数配合 DESeq2 或 edgeR 的标准化和离散度模型。
- 只用单一工具检出 circRNA：不同工具对比对错误和基因组重复区的处理不同，单工具结果中常含大量假阳性反向剪接位点。
- 靶基因只取一个预测数据库：不同算法召回率差别很大，一般取多个数据库交集或结合实验验证库，再用表达负相关进一步筛选。
- 把芯片重注释的 lncRNA 与 RNA-seq 鉴定结果按名称直接合并：两者注释版本和探针覆盖不同，同名 lncRNA 可能对应不同转录本。
- 忽视 circRNA 与宿主基因的关系：circRNA 计数变化可能只是宿主基因转录变化，应同时报告线性转录本表达或环化比例。
结果怎么看
小 RNA 长度分布与组成图
横轴是 reads 长度，纵轴是比例，并按 RNA 类别着色。miRNA 文库应在 22 nt 附近形成主峰；若 rRNA、tRNA 片段占比过高或峰位偏移，说明 RNA 降解或片段选择不佳，后续差异结果要谨慎解读。
新 lncRNA 特征对比
比较新 lncRNA、已知 lncRNA 与 mRNA 的长度、外显子数、表达量和保守性。lncRNA 一般比 mRNA 更短、外显子更少、表达更低；如果新转录本的特征接近 mRNA，要回查编码潜能过滤。
circRNA 检出表
每行一个 circRNA，含坐标、宿主基因、BSJ reads 数、检出工具和环化比例。重点看多工具共同检出且 reads 数在重复间稳定的分子；绝大多数只有 1–2 条 reads 时，提示测序深度不足。
差异表达火山图
读法与 mRNA 火山图相同，但要额外看低表达特征是否主导了显著结果。如果显著的 lncRNA 或 circRNA 平均计数大多只有个位数，应提高过滤阈值后重跑。
miRNA-靶基因与 ceRNA 网络
节点是 miRNA、mRNA、lncRNA 或 circRNA，边代表预测结合且表达负相关。网络适合做候选优先级排序；边数过多说明相关性阈值太松，筛选价值有限。
和相近方法怎么选
lncRNA 鉴定与常规基因定量
常规定量只统计已注释基因，适合已知 lncRNA 的差异分析；需要发现新转录本或物种注释不全时，才走组装加编码潜能过滤的流程，代价是计算量更大、假阳性更多。
miRDeep2 与直接比对计数
miRDeep2 能同时预测新 miRNA 并给出可信度评分；只关心已知 miRNA 时，直接比对成熟序列计数更简单。研究 isomiR 时，需要选择能区分长度和末端变异的定量方式。
CIRI2 与 CIRCexplorer2
CIRI2 基于比对中的成对嵌合剪切信号识别反向剪接，不依赖注释；CIRCexplorer2 依赖注释的外显子边界，结果更贴近已知剪接位点。为减少假阳性，常把两者结果取交集。
非编码 RNA 分析与 CLIP-seq
表达层面的靶标预测只能给出候选关系；要证明 AGO 或某个 RNA 结合蛋白直接结合目标 RNA，需要 CLIP 类实验提供的结合位点证据。两类结果结合，ceRNA 推断更可信。
常见问题
lncRNA 分析需要什么样的测序数据
建议用链特异性、去 rRNA 的总 RNA-seq，双端测序，深度高于常规 mRNA 差异分析，因为 lncRNA 普遍低表达。polyA 文库也能检出部分 lncRNA，但会漏掉非多聚腺苷酸化的转录本；反义 lncRNA 的方向判断依赖链特异性。
怎么判断一个转录本不编码蛋白
常用多个编码潜能工具综合判断，如 CPC2、CPAT、PLEK，再检索 Pfam 结构域。工具判为非编码只说明编码可能性低；如果有 Ribo-seq 或质谱数据，可以进一步排除其中小 ORF 被翻译的情况。
circRNA 为什么要做 RNase R 处理
RNase R 降解线性 RNA，而环状 RNA 没有游离末端，能抵抗消化。比较处理前后，真实 circRNA 应保持稳定或被相对富集，线性转录本明显减少，这可以作为测序检出结果的佐证。
小 RNA 测序数据里 rRNA 很多正常吗
小 RNA 文库中有一定比例的 rRNA 和 tRNA 片段是常见的，但若占比远超 miRNA，通常说明 RNA 降解或起始量不足。此时可用于 miRNA 定量的 reads 大幅减少，差异分析的统计功效会下降。
ceRNA 网络分析可信吗
ceRNA 网络是基于预测结合和表达相关构建的假设，相关不等于调控。可信度取决于结合位点证据、分子拷贝数是否足以形成竞争，以及荧光素酶报告、敲低等实验验证，建议把网络当作候选筛选工具。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 里描述研究问题后，会先确认要做 lncRNA 鉴定、miRNA 定量还是 circRNA 识别，以及分组与对照设置；随后读取本地 FASTQ、计数矩阵或下载公开数据，运行质控、比对、鉴定、定量和差异分析，并做靶标预测与网络整理，交付检出表、长度分布图、火山图、靶标与网络结果表、分析报告和可复现脚本。
我有 6 例肿瘤和 6 例癌旁的小 RNA 测序 FASTQ，想找差异 miRNA、预测靶基因，并和同批 mRNA 表达做负相关筛选