CLIP-seq 与 RNA 结合蛋白位点分析
CLIP-seq（交联免疫沉淀测序）用紫外线把 RNA 结合蛋白（RBP）与直接接触的 RNA 共价交联，再经免疫沉淀、RNA 片段化和建库测序，在全转录组范围内定位 RBP 的结合位点。常见变体有 HITS-CLIP、PAR-CLIP（细胞掺入 4SU 后，交联位点在测序中出现 T-to-C 转换）、iCLIP 和 eCLIP（利用反转录在交联位点的截断，把位置定位到单个核苷酸）。eCLIP 引入了大小匹配的 input（SMInput）作为背景对照。分析核心是去除 PCR 重复、准确定位交联位点、相对背景识别显著富集的峰，再做区域分布、motif 和功能整合分析。
什么时候用
- 鉴定某个 RBP 在全转录组的直接结合位点和区域偏好
- 寻找 RBP 结合的序列 motif，验证已知结合偏好
- 结合 RBP 敲低后的 RNA-seq，区分直接靶标和间接效应
- 分析剪接因子在外显子和内含子上的结合位置与剪接调控关系
- 定位 AGO 结合位点，确定 miRNA 在转录本上的实际作用位置
- 再分析 ENCODE 等公开 eCLIP 数据，查询目标 RNA 的结合蛋白
不适合的情况
- 对 RIP-seq 数据套用单核苷酸定位流程，RIP 没有交联截断信息
- 没有背景对照就把所有高覆盖区当作结合位点，高表达转录本会主导结果
- 用峰高直接比较不同 RBP 的结合强度，不同抗体的富集效率差别很大
需要准备的数据
- CLIP 文库 FASTQ
- 需明确实验类型（eCLIP、iCLIP、PAR-CLIP 等）、接头与 UMI 位置，以及哪条读段对应 RNA 正义链
- 背景对照文库
- eCLIP 的 SMInput、IgG 对照或同细胞 RNA-seq，用于扣除表达量和非特异结合背景
- 参考基因组与注释
- 含 UTR、内含子和非编码 RNA 注释的 GTF；重复元件注释有助于解读多比对区域
- 重复与样本信息
- 建议至少两个生物学重复，记录细胞类型、抗体和处理条件
分析步骤
- 1
去接头与提取 UMI
按文库结构去除接头，把 UMI 移到 reads 名称中。iCLIP 与 eCLIP 的 barcode 和 UMI 位置不同，需按协议设置。处理后过短的 reads 应丢弃，以免产生大量多比对。
- 2
去重复元件与比对
常先比对到 rRNA 和重复元件序列去除，再用 STAR 比对基因组。比对率异常低时，先检查接头和 barcode 是否去除干净。
- 3
PCR 去重
基于比对位置和 UMI 去除重复，常用 UMI-tools 等工具。CLIP 文库复杂度普遍较低，去重后剩余的 reads 数是判断数据能否继续分析的关键指标。
- 4
交联位点定位
iCLIP 和 eCLIP 中交联位点位于反转录截断处，即 cDNA 起点前一个核苷酸；PAR-CLIP 则依据 T-to-C 转换定位。统计每个位置的交联事件数，形成单核苷酸分辨率信号。
- 5
峰检测
常用 CLIPper、PureCLIP、Piranha，PAR-CLIP 可用 PARalyzer。eCLIP 常在 CLIPper 峰的基础上与 SMInput 比较，计算富集倍数和显著性，只保留显著富集的峰。
- 6
重复一致性
用 IDR 或重叠比例评估两个重复，保留可重复的峰。可重复峰很少时，通常是 IP 效率或文库复杂度不足，增加测序量往往无济于事。
- 7
区域分布与 motif
统计峰在 5'UTR、CDS、3'UTR、内含子和非编码 RNA 上的比例；以交联位点或峰顶为中心截取短窗口，用 HOMER 或 MEME 套件找 motif，与已知结合偏好对照。
- 8
靶标整合
把结合基因与 RBP 敲低或敲除后的差异表达、可变剪接结果交叉，找同时满足直接结合和功能变化的靶标；剪接因子常画 RNA map 展示结合位置与外显子包含变化的关系。
关键参数与决策
峰富集阈值
eCLIP 常用相对 SMInput 的富集倍数和 P 值双重过滤，ENCODE 处理中常见的标准是 log2 富集倍数与 -log10(P) 均不低于 3。探索性分析可适当放宽，但要在结果中写明阈值。
背景对照选择
SMInput 能同时扣除表达量和实验流程带来的非特异背景，比单纯用 RNA-seq 更贴近 CLIP 的偏差。没有 SMInput 时可用同细胞 RNA-seq 校正表达，但会残留部分非特异信号。
交联位点偏移与读段选择
不同协议中交联位点相对 reads 起点的位置和所在读段不同，需按文库结构确定。设定错误时信号会变宽、偏离真实位点，motif 也不再集中于峰中心。
多比对 reads
不少 RBP 结合重复元件，只用唯一比对 reads 会丢失这部分信号。研究重复元件结合时，需要按重复元件家族汇总计数的专门策略。
去重方式
有 UMI 时按位置加 UMI 去重；没有 UMI 时只能按位置去重，会把真实的独立交联事件也合并，高信号位点被低估得更明显。
常见错误
- 不去 PCR 重复：CLIP 文库扩增轮数多，少数分子的大量拷贝会形成虚假的强峰，使 motif 和靶标列表被个别位点主导。
- 只做 CLIP 不设背景：高表达转录本即使非特异结合也有高覆盖，峰列表会变成表达量排名，失去结合特异性信息。
- 在整个宽峰上找 motif：峰常比真实结合位点宽，应以交联位点或峰顶为中心截取短窗口，否则 motif 信号会被稀释。
- 认为所有结合峰都调控所在基因：结合不等于功能调控，需要与敲低后的表达、剪接或稳定性变化整合，才能确定功能靶标。
- PAR-CLIP 中不过滤 SNP：样本自身的 T/C 多态会被当成交联诱导的转换，需用 RNA-seq 或已知变异数据过滤。
结果怎么看
峰区域分布图
显示峰在 UTR、CDS、内含子等区域的比例。剪接因子常富集于内含子，影响 mRNA 稳定性的 RBP 常富集于 3'UTR；分布与该 RBP 已知功能明显不符时，先排查抗体特异性。
Motif 富集结果
列出峰中心附近富集的序列、P 值和覆盖比例。排名靠前的 motif 与文献已知偏好一致，可佐证数据质量；若排在前列的是 rRNA 或重复序列片段，说明背景去除不充分。
峰列表
每行一个峰，含坐标、基因、区域、CLIP 与对照计数、富集倍数和 P 值。优先关注在重复中都出现、富集倍数高，且所在基因在功能实验中也有变化的峰。
RNA map
剪接因子分析常用图：横轴为相对受调控外显子剪接位点的位置，纵轴为结合信号，分别画包含增加和减少的外显子。结合位置与剪接变化方向有规律地对应，是支持直接调控的证据。
交联信号轨迹
在单个基因上并排展示 CLIP 与对照的交联信号。真实结合位点在 CLIP 中呈尖锐堆积而对照平坦；两者形状相同只是高度不同时，更可能是背景。
和相近方法怎么选
eCLIP 与 iCLIP
两者都利用反转录截断定位交联位点。eCLIP 增加了大小匹配 input，背景校正更规范，ENCODE 用它产出了大量数据；iCLIP 的建库细节不同。分析上主要差别在 barcode、UMI 和读段方向的设置。
CLIP-seq 与 RIP-seq
RIP-seq 不交联，回收与 RBP 共沉淀的完整 RNA，能反映结合 RNA 的种类，但包含间接结合且无法定位位点；CLIP 交联后严格洗涤，能给出直接结合的位置。需要位点信息时选 CLIP。
CLIP-seq 与蛋白质-RNA 互作预测
计算预测可在没有实验数据时提供候选，适合缩小范围；CLIP 是细胞内的实验证据。两者结合时，可用预测解释 CLIP 峰的结合模式，而不是用预测替代实验。
CLIP-seq 与 MeRIP-seq
两者都依赖抗体富集 RNA，但 MeRIP 富集的是修饰而非蛋白结合，不交联，分辨率为峰区间。研究 m6A 阅读蛋白时，可把两类峰叠加，看结合位点与修饰是否共定位。
常见问题
eCLIP 的 SMInput 是什么
SMInput 是在免疫沉淀前取部分交联裂解物，经过同样的电泳转膜和相同分子量范围切取后建库测序。它代表该大小范围内所有 RNA-蛋白复合物的背景，因此比普通 input 或 IgG 更适合计算 CLIP 的特异富集。
CLIP-seq 一般做几个重复
常见做法是至少两个生物学重复，再用 IDR 或重叠比例保留可重复峰。重复间一致性低时，增加测序量通常解决不了问题，应先改善 IP 效率和文库复杂度。
CLIP 峰很少正常吗
峰数与 RBP 本身的结合广度、抗体效率和文库复杂度有关。去重后 reads 很少时峰也会很少，此时先看重复率；如果文库复杂度正常而峰仍然少，可能该蛋白的结合本身高度选择性。
怎么判断结合位点是否有功能
常见做法是结合 RBP 敲低或敲除后的 RNA-seq，看结合基因是否在表达、剪接或稳定性上发生变化，再用报告基因突变结合位点验证。结合与功能变化一致的，才是较可靠的直接功能靶标。
公开的 CLIP 数据去哪里找
ENCODE 提供了 K562 和 HepG2 细胞中大量 RBP 的 eCLIP 数据，GEO 中也有各类 CLIP 数据集。再分析前要确认细胞类型、实验协议和处理流程，与自己的研究体系不一致时，结论外推需谨慎。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 里说明目标 RBP、实验类型和对照后，会确认文库结构、重复和物种，读取本地 FASTQ 或下载 ENCODE、GEO 等公开数据；随后完成接头与 UMI 处理、比对去重、交联位点定位、峰检测与重复一致性评估，再做区域分布和 motif 分析，交付峰表、区域分布图、motif 结果、目标基因信号轨迹图、分析报告和可复现脚本。
帮我下载 ENCODE 上 RBFOX2 在 HepG2 的 eCLIP 数据，找可重复的结合位点，看是否富集 GCAUG motif 以及在内含子的分布