RNA 修饰分析：m6A 与 MeRIP-seq
N6-甲基腺苷（m6A）是真核 mRNA 上最丰富的内部修饰，由 METTL3–METTL14 甲基转移酶复合物写入、FTO 和 ALKBH5 去除、YTHDF 等阅读蛋白识别，影响 RNA 稳定性、剪接和翻译。MeRIP-seq（也称 m6A-seq）用抗 m6A 抗体富集含修饰的 RNA 片段，与未富集的 input 文库一起测序，通过 IP 相对 input 的富集识别修饰峰，定位精度受 RNA 片段长度限制，通常在一百到数百碱基的区间级别。需要单碱基位置时可用 miCLIP 或纳米孔直接 RNA 测序。典型分析包括峰检测、motif 与分布检查、差异甲基化，以及与表达、翻译数据的联合解读。
什么时候用
- 敲低或过表达 METTL3、FTO、ALKBH5 后，寻找修饰水平改变的转录本
- 比较疾病与正常组织的 m6A 修饰图谱和峰分布差异
- 检查 MeRIP-seq 质量：峰是否富集 DRACH motif 和终止密码子附近
- 联合 RNA-seq 或 Ribo-seq，判断修饰变化与表达、翻译变化的关系
- 定位候选基因上的修饰峰，为 MeRIP-qPCR 设计引物区域
不适合的情况
- 只测 IP 没有 input 对照，无法区分修饰富集和表达高
- 需要单碱基精度时只用 MeRIP-seq，峰区内无法确定被修饰的 A
- 把 MeRIP 峰直接等同于 m6A，抗体也会识别 m6Am 等相近修饰
需要准备的数据
- IP 与 input FASTQ
- 每个样本成对的 IP 和 input 文库，建议每组有生物学重复，并记录文库链方向
- 参考基因组与注释 GTF
- 峰注释和转录本坐标转换都依赖注释，版本需与比对一致
- 样本分组表
- 列出样本、条件、IP 与 input 的配对关系和批次，差异分析需要这些信息建模
- 扰动处理信息（可选）
- 如有 writer、eraser 敲低或抑制剂处理，记录方式和时间，便于解释整体修饰变化
分析步骤
- 1
质控与比对
去接头后用 HISAT2 或 STAR 比对基因组。IP 文库起始量低、重复率常偏高，要检查重复率、rRNA 比例和比对率；IP 与 input 的比对率相差很大，提示抗体富集或建库有问题。
- 2
峰检测
常用 exomePeak2、MeTPeak 或 MACS2 在 IP 对 input 上找峰。exomePeak2 和 MeTPeak 基于转录本坐标建模，能处理跨外显子的峰；MACS2 按基因组坐标计算，跨剪接位点的峰可能被切断，需要额外处理。
- 3
重复一致性评估
比较各重复峰集的重叠比例，或用 IDR 等方法保留可重复峰。重复间重叠率很低时，多半是抗体批次或 IP 效率问题，应先排查实验再继续分析。
- 4
Motif 与分布检查
用 HOMER 或 MEME 套件在峰中心区域找 motif，应出现 DRACH（RRACH）共有序列；用 Guitar 等工具画 metagene 图，哺乳动物 m6A 峰通常富集于终止密码子附近和 3'UTR。两项都不符时，数据可信度要打问号。
- 5
差异甲基化分析
在合并峰集上统计 IP 和 input 计数，用 exomePeak2、RADAR 或 QNB 等方法比较条件间的 IP/input 比值。关键是把 input 的表达变化纳入模型，否则表达上调会被误判为甲基化增加。
- 6
联合表达分析
用 input 计数做差异表达，把差异甲基化峰与差异表达基因画成四象限图，筛选修饰与表达同向或反向变化的基因；如有阅读蛋白的 CLIP 数据，可判断差异峰是否被直接识别。
- 7
候选结果整理
对重点基因画 IP 与 input 的覆盖轨迹，标出峰位置和所在区域（5'UTR、CDS、终止密码子附近、3'UTR），作为 MeRIP-qPCR 引物设计和机制实验的依据。
关键参数与决策
峰显著性阈值
常用 FDR 0.05 再结合富集倍数筛选。阈值太松会引入大量低富集峰，冲淡 motif 和分布信号；太严会丢掉低表达基因上的真实峰，可结合重复一致性综合确定。
片段长度与窗口
MeRIP 的 RNA 通常打断到约 100 nt 级别，峰检测窗口应与片段长度匹配。窗口远大于片段长度会合并相邻峰，降低定位精度，也会让 motif 搜索区域过宽。
差异甲基化模型
选择能同时建模 IP 和 input 的方法，并在设计矩阵中加入批次等协变量。每组无重复时只能做探索性比较，不宜报告 P 值结论。
坐标体系
修饰峰常跨越剪接位点，基于转录本坐标的工具定位更准确；用基因组坐标的工具时，需要在注释阶段把峰映射回具体转录本区域，再统计区域分布。
整体修饰水平变化
writer 敲低后全转录组 m6A 可能普遍下降，按文库大小标准化会把整体下降部分抵消。这种情况需要 spike-in 或 LC-MS/MS 测定的整体 m6A 水平辅助解释。
常见错误
- 用 IP 计数直接做 DESeq2 差异：IP reads 同时反映修饰水平和表达量，不校正 input 会把表达上调的基因误判为高甲基化。
- 忽略 IP 文库的 PCR 重复：IP 起始量低、重复率高，不评估或不去重会造成峰虚高，在高表达短转录本上尤其明显。
- 用峰数量比较组间修饰高低：峰数受测序深度和 IP 效率影响，组间峰数差异不能说明修饰增减，需要在统一峰集上定量比较。
- 把峰内所有 A 都当作修饰位点：MeRIP 峰宽常达上百碱基，具体位点需要单碱基方法或位点突变实验确定。
- 跨物种套用哺乳动物的质量标准：植物、酵母等物种的 m6A 序列偏好和分布特征有差异，应参考该物种已发表的图谱判断。
结果怎么看
峰分布 metagene 图
横轴把转录本分为 5'UTR、CDS、3'UTR 三段，纵轴是峰密度。哺乳动物数据应在终止密码子附近出现最高峰；分布均匀或集中在 5' 端，提示抗体特异性或片段化存在问题。
Motif 富集结果
列出峰中富集的序列及显著性和背景比例。DRACH 排在前列说明峰质量较好；如果排在前面的是富含 GA 的序列或重复序列，可能是非特异结合或 input 校正不足。
差异甲基化峰表
每行一个峰，含坐标、基因、所在区域、IP/input 富集倍数变化和 FDR。重点看富集变化与 input 表达变化方向不同的峰；变化完全跟随表达的峰需谨慎解读。
甲基化与表达四象限图
横轴是差异甲基化倍数，纵轴是差异表达倍数，四个象限对应不同的调控模式。如果点集中在对角线附近，说明甲基化差异可能被表达变化带动，需要回看模型是否纳入 input。
覆盖轨迹图
按基因组浏览器样式对比 IP 与 input 覆盖。真实峰在 IP 中明显突起而 input 平坦；IP 与 input 形状一致、只是高度不同，更可能反映表达差异而非修饰。
和相近方法怎么选
MeRIP-seq 与 miCLIP
MeRIP-seq 实验门槛低、数据积累多，但分辨率是峰区间；miCLIP 利用抗体交联诱导的突变或截断定位到单碱基，起始量和建库难度更高。要做位点突变实验时，优先考虑单碱基方法。
MeRIP-seq 与纳米孔直接 RNA 测序
直接 RNA 测序不需要抗体，可在单分子上读出修饰信号并估计修饰比例，但依赖训练好的识别模型，不同化学版本和工具的结果需要对照；MeRIP-seq 流程更成熟，适合多样本比较。
差异甲基化与差异表达分析
差异表达比较 mRNA 丰度；差异甲基化比较 IP 相对 input 的富集变化，回答修饰水平是否改变。两者需要联合解读，只看其一容易把表达变化误归因于修饰。
MeRIP-seq 与 ChIP-seq
两者都是抗体富集后找峰，但 MeRIP 富集的是 RNA，峰位于转录本上并会跨剪接位点，input 代表表达量而非基因组背景，因此不宜照搬 ChIP-seq 的流程和阈值。
常见问题
MeRIP-seq 需要几个生物学重复
差异甲基化统计依赖生物学重复，常见做法是每组至少 2–3 个。只有单样本时只能描述峰分布，无法估计组内变异，差异结果只能作为探索线索，需要 MeRIP-qPCR 等实验验证。
m6A 峰为什么集中在终止密码子附近
这是在哺乳动物 mRNA 上被反复观察到的分布特征，其形成机制仍在研究中。在数据分析中，它常被当作质量检查指标：如果峰分布明显偏离这一特征，应先怀疑抗体、片段化或流程设置。
MeRIP-seq 用什么软件找峰
常用 exomePeak2、MeTPeak 和 MACS2。exomePeak2 同时支持峰检测和差异甲基化，并考虑 GC 含量偏好；MACS2 使用广泛但为 DNA 设计，跨剪接位点的峰需要额外处理。可在同一数据上比较峰数和 motif 富集再选择。
input 样本起什么作用
input 是同一 RNA 未经抗体富集的文库，代表转录本的表达背景。峰检测时用它判断富集是否显著，差异分析时用它扣除表达变化的影响，input 本身也可以用于常规差异表达分析。
MeRIP-seq 能得到修饰比例吗
不能。MeRIP-seq 给出的是相对富集，不是每个位点被修饰的分子比例。估计位点修饰化学计量需要可定量的单碱基方法或纳米孔直接 RNA 测序；样本整体 m6A 水平通常用 LC-MS/MS 测定。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 里说明实验设计后，会确认 IP 与 input 的配对、分组和物种，再读取本地 FASTQ 或比对文件，或下载公开 MeRIP-seq 数据；随后完成质控、比对、峰检测、motif 与分布检查和差异修饰分析，交付峰表、metagene 分布图、motif 结果、差异峰表与覆盖图、分析报告和可复现脚本。
我有 METTL3 敲低和对照各 3 个重复的 MeRIP-seq，IP 和 input 都有，想找差异 m6A 峰并和表达变化联合看