蛋白质-RNA 相互作用预测
RNA 结合蛋白（RBP）通过识别 RNA 上的序列基序和局部结构，参与剪接、稳定性、定位和翻译调控。蛋白质-RNA 相互作用预测要回答两个层次的问题：一是给定 RBP 和一段 RNA，哪些位置可能被结合，结合偏好是什么基序；二是给定蛋白序列和 RNA 序列，二者形成的复合物长什么样，哪些残基和哪些碱基接触。前者常用基序扫描和基于 CLIP 数据训练的序列模型，典型输入是转录本序列加候选位点区间；后者用支持核酸的结构预测模型或蛋白-RNA 对接，输入是蛋白序列或已有结构加 RNA 序列。两条路线的结论都是假设，需实验验证。
什么时候用
- 已知某个 RBP，想在候选转录本上找出可能的结合区段
- CLIP 实验得到峰区，想解释峰内哪些基序和结构特征驱动结合
- 需要蛋白-RNA 复合物的结构模型，用于指导突变设计
- 想定位 RNA 结合界面的关键残基，为点突变去结合实验选位点
- 比较同一 RBP 对野生型与突变型 RNA 序列的结合倾向
- 评估 RNA 二级结构开放性对结合可及性的影响
不适合的情况
- 想直接得到结合亲和力的绝对数值：现有方法给的是相对倾向或打分，不是 Kd
- RNA 很长且高度结构化（如全长 lncRNA）：整体复合物建模可靠性低
- 蛋白为无序区主导的识别：缺少稳定界面，结构模型置信度通常很差
需要准备的数据
- 蛋白序列或结构
- FASTA 序列，或 PDB 结构。有已解析的同源复合物结构时优先使用，能大幅提高建模可靠性
- RNA 序列
- FASTA，建议截取结合区上下游各几十个碱基的片段；碱基用 ACGU，注意区分 T 与 U
- 候选区间或 CLIP 峰
- BED 格式的峰区或区间，含链方向；坐标与所用转录本、基因组版本一致
- 基序模型
- 该 RBP 已知的 PWM 或共识基序，来自公共基序库；没有时只能靠序列模型给出的打分
- 背景序列集
- 做基序富集时需要匹配长度和区域类型的背景（如打乱序列或同区域非峰序列）
分析步骤
- 1
明确预测目标
先区分要做位点预测还是复合物建模。位点预测输出的是 RNA 上的区段和打分，复合物建模输出的是三维坐标和界面接触。两者的输入准备、评价指标和能支撑的结论完全不同，混在一起做容易得出过度解读的结论。
- 2
整理序列与区间
统一转录本版本和坐标系，确认链方向正确。做基因组坐标到转录本坐标的转换时，检查是否跨外显子。RNA 片段两端各留一段余量，避免把真实结合位点截在边界上，但也不要长到让模型注意力分散。
- 3
基序扫描与富集
用已知 PWM 在候选区间上扫描，记录位置和得分；再与背景序列比较，看该基序是否真的富集。只看单条序列上有命中不能说明问题，富集倍数和显著性才有参考价值。基序通常很短，随机出现的概率不低。
- 4
评估结构可及性
用 RNA 二级结构预测给出每个碱基的单链概率或可及性。许多 RBP 偏好单链暴露区，基序藏在稳定茎区时结合概率下降。把可及性作为筛选候选位点的第二个条件，能减少假阳性。
- 5
构建复合物模型
用支持核酸链的结构预测模型（如 AlphaFold 3、RoseTTAFold2NA）或蛋白-RNA 对接程序（如 HDOCK）生成复合物。多跑几个随机种子或保留多个构象，看不同模型的界面是否一致。界面飘忽说明预测不可靠。
- 6
读置信度指标
看界面层面的指标：ipTM 或界面打分反映两条链相对位置的可信度，PAE 矩阵中蛋白与 RNA 之间的块状区域颜色越深越好。单链内部 pLDDT 高但链间 PAE 很差，意味着两个分子各自折对了、相互位置没定下来。
- 7
提取界面残基
在模型里统计与 RNA 原子距离在 4 到 5 Å 内的蛋白残基，区分与磷酸骨架接触（多为 Lys、Arg）和与碱基接触（芳香堆积、氢键）的残基。骨架接触通常提供亲和力，碱基接触决定序列特异性。
- 8
设计验证方案
把预测转成可测的假设：挑 2 到 3 个碱基特异性残基做点突变，或在 RNA 基序上做点突变，用 EMSA、RIP-qPCR 或 CLIP 检验结合是否下降。预测只负责缩小实验范围。
关键参数与决策
RNA 片段长度
复合物建模常用几十个碱基的片段。片段过短会丢掉形成结合构象所需的茎环，过长会引入大量柔性区域，使界面置信度整体下降。可以先用长片段定位，再用截短片段精修。
基序打分阈值
PWM 扫描的阈值决定假阳性率。阈值放宽会在任意序列上都找到命中，建议用背景序列估计同一阈值下的期望命中数，再据此取值，并报告富集倍数而不是单纯的命中数。
可及性窗口
计算单链概率时需要指定窗口长度，窗口太短只反映局部配对，太长会被远距离配对主导。常见做法是取与基序长度相近的窗口，并同时报告基序两侧的开放情况。
界面接触距离
统计接触时阈值常取 4 Å 或 5 Å。阈值放大会把第二层残基算进来，使界面看起来更大。做突变选点时宜用较严的阈值，描述结合口袋时可以放宽，但要在结果里写明用了哪个值。
模型数量与种子
一次只出一个模型无法判断稳定性。常规做法是生成多个模型，比较界面残基集合的重合度，重合度高才把该界面当作预测结论，否则只报告不确定。
常见错误
- 把 T 当成 U 或把 RNA 当 DNA 提交：模型会按错误的核酸类型建模，糖环和配对偏好都变，结果不可用。
- 只看单链 pLDDT 就宣称复合物预测成功：蛋白自己折得好不代表 RNA 的位置对，必须看链间 PAE 或 ipTM。
- 基序扫描不做背景比较：短基序在随机序列中频繁出现，只报命中位置会得出几乎任何 RNA 都结合的结论。
- 忽略 RNA 二级结构：基序落在稳定茎区时体内往往不可及，预测位点与 CLIP 峰对不上多半出在这一步。
- 用整条长链 RNA 做复合物建模：柔性过大，输出的构象多为低置信度堆叠，界面残基没有参考意义。
- 把预测界面直接当作功能结论：去结合突变也可能破坏蛋白折叠，需要同时检查突变体的稳定性和表达。
结果怎么看
结合位点打分曲线
横轴是 RNA 位置，纵轴是打分或概率。看是否出现集中的峰而不是整条序列都偏高；如果打分沿全长平坦或与 GC 含量趋势一致，说明模型主要在拟合碱基组成，而不是识别基序。
基序富集结果
给出基序、富集倍数、显著性和在峰内的位置分布。可信的结果通常在峰中心附近富集；如果基序均匀分布在峰区和背景区，说明这个基序不是驱动结合的特征。
复合物模型与置信图
看 RNA 是否落在蛋白已知的核酸结合域一侧。PAE 矩阵里蛋白-RNA 对应的块应明显比边角深；若 RNA 贴在蛋白表面随机位置且块状区全是浅色，这个模型不能用于后续分析。
界面接触表
列出残基、碱基、接触类型和距离。合理的界面通常同时含带正电残基与骨架磷酸的接触，和芳香残基与碱基的堆积；若界面只有少数几个接触点，亲和力预期很弱。
和相近方法怎么选
序列位点预测与结构复合物建模
序列方法快、能扫全转录组，但只给位置和打分，不解释作用机制；结构建模能给界面残基和接触细节，但一次只能处理短片段且置信度波动大。常规做法是先用序列方法筛区段，再对少数重点区段做结构建模。
预测与 CLIP 实验
CLIP 测的是细胞内真实发生的交联位点，受表达量、可及性和交联偏好影响；预测给的是序列和结构层面的倾向，不受表达限制。两者互补：预测可以解释 CLIP 峰为何在此，CLIP 可以筛掉在细胞里根本不表达的预测位点。
蛋白-RNA 对接与端到端结构预测
对接需要已有的蛋白结构和 RNA 构象，适合界面大致已知、想枚举结合姿态的情况；端到端模型从序列直接出复合物，省去构象准备，但对训练数据覆盖少的 RBP 家族可靠性下降。两类方法结果一致时结论更可信。
常见问题
蛋白质-RNA 复合物预测现在准不准
取决于体系。有同源复合物结构、RNA 片段短且有明确茎环的情况下，界面常能大致复现；对新家族 RBP、长链柔性 RNA 或以无序区介导的结合，预测结果经常不可靠。判断标准不是看图好不好看，而是看链间置信度指标以及多个模型的界面是否一致。
没有实验结构能做蛋白-RNA 预测吗
可以。端到端结构预测模型只需要蛋白序列和 RNA 序列。不过有实验结构或同源复合物作参考时，可以用来核对预测界面是否落在已知的核酸结合域上，这一步校验往往比模型自身的打分更能说明问题。
怎么判断预测的结合位点值不值得做实验
通常要同时满足三条：基序在候选区相对背景有富集、位点所在区段的单链可及性较高、如果做了结构建模则界面在多个模型中稳定。三条都满足的位点优先做 EMSA 或 RIP-qPCR；只满足一条的位点假阳性比例较高。
RBP 结合预测和 CLIP 峰不一致怎么办
先排除坐标和链方向错误，再看表达量和可及性。预测有位点而 CLIP 没有，常见原因是该转录本在所测细胞中不表达或位点被二级结构封闭；CLIP 有峰而预测没有，可能是间接结合，或该 RBP 通过与其他蛋白形成复合物被交联下来。
在 Codar 里怎么做
在生信模式里描述目标蛋白和 RNA，Codar 会先确认是做结合位点预测还是复合物建模，再准备序列与区间、运行蛋白质-RNA 相互作用预测、整理界面接触与置信度指标，交付结合位点打分表、复合物结构文件、界面残基清单和可视化图，以及可复现脚本。
我有一个 RBP 的蛋白序列和一段 300 nt 的 3'UTR 序列，想预测它可能的结合位点，并对打分最高的区段建一个蛋白-RNA 复合物模型，给出界面残基。