蛋白质结构预测（AlphaFold、ESMFold）
蛋白质结构预测是根据氨基酸序列推断三维结构的计算方法。AlphaFold2 利用多序列比对（MSA）中的共进化信息和结构模板，对很多结构域能给出接近实验精度的模型；ESMFold 只用单条序列，靠蛋白语言模型，速度快得多。AlphaFold-Multimer 面向蛋白多聚体，AlphaFold3 还能同时建模核酸、配体和离子。输入是 FASTA 序列，输出是带每残基置信度的 PDB 或 mmCIF 文件和残基对误差矩阵。可用于划分结构域、定位突变位点、设计截短体，或为对接和模拟准备起始结构。
什么时候用
- 目标蛋白在 PDB 中没有实验结构，需要一个可用的起始模型
- 判断结构域边界和无序区，用于设计截短体或表达构建体
- 把错义突变、磷酸化等修饰位点映射到三维结构上看空间位置
- 推测两个蛋白是否可能直接结合，以及大致的界面残基
- 为分子对接、分子动力学模拟准备受体结构
- 对同一家族的多个同源蛋白批量建模，比较结构差异
不适合的情况
- 预测单个点突变对稳定性或活性的影响：模型对单残基变化通常不敏感
- 研究构象变化或配体诱导的结构变化：预测一般只给出一个主导构象
- 把低置信度的无序区当作真实折叠结构来解读
需要准备的数据
- 蛋白序列 FASTA
- 标准氨基酸单字母序列；去掉纯化标签，明确是否保留信号肽，与实际研究的构建体保持一致
- 多聚体组成
- 写清每条链的序列和拷贝数，同源二聚体需输入两条相同序列；化学计量比应有实验或文献依据
- 复合物其他组分
- 核酸给出序列，小分子给 SMILES 或 PDB 化学组分代码，离子和辅因子单独列出
- 参考实验结构（可选）
- 已有同源 PDB 结构时可作为模板，或用于计算 TM-score、RMSD 评估预测结果
- UniProt 编号（可选）
- 用于先查 AlphaFold Protein Structure Database 是否已有预计算模型，避免重复计算
分析步骤
- 1
检索已有结构
先在 PDB 和 AlphaFold Protein Structure Database 中按 UniProt 编号检索。有高分辨率实验结构时优先使用实验结构；已有预计算模型且序列与研究对象一致时可直接下载。
- 2
整理序列与构建体
核对序列与实际表达的构建体是否一致，去掉标签。超长蛋白考虑按结构域拆分；多聚体先依据实验或文献确定拷贝数，再决定输入几条链。
- 3
生成多序列比对
AlphaFold 系列先搜索同源序列构建 MSA，ColabFold 用 MMseqs2 加速这一步。查看 MSA 覆盖度图：同源序列很少或只覆盖部分区域时，对应区域的置信度通常也会偏低。
- 4
运行预测
单体通常输出 5 个模型并按置信度排序；多聚体和难预测的目标可增加随机种子数量获得更多候选。确认输出模型的链数、长度与输入一致，没有被截断。
- 5
结构弛豫
用 Amber 力场做短暂能量最小化，消除原子间的立体冲突。弛豫只做局部修正，前后主链 RMSD 应很小；如果变化很大，说明原始模型存在严重问题。
- 6
读取置信度
按残基查看 pLDDT，结合 PAE 矩阵判断结构域之间的相对位置是否可靠；复合物重点看 ipTM 和链间区域的 PAE。只对置信度高的区域做精细解读。
- 7
结构质量评估
用 MolProbity 等工具检查 Ramachandran 图、clashscore 和侧链构象；有实验结构时计算 TM-score 和 RMSD，复合物界面可用 DockQ 与实验结构比较。
- 8
整理下游用结构
用于对接或模拟前，截掉 pLDDT 很低的柔性末端，并确认口袋区域的置信度足够高。保留原始模型和置信度文件，方便追溯和复查。
关键参数与决策
预测工具选择
AlphaFold2 或 ColabFold 需要 MSA，精度通常更高但更耗时；ESMFold 单序列推理快，适合大批量初筛；含核酸、配体的复合物需要 AlphaFold3 这类支持多种分子的模型。
是否使用模板
模板在有同源结构时能提高准确度，但也会把模型拉向模板的构象。研究不同于已知结构的状态时，可对比开启和关闭模板的结果，观察关键区域是否改变。
循环次数（recycles）
模型把上一轮输出再输入进行迭代优化，AlphaFold2 原始设置为 3 次。难预测的目标增加循环次数有时能提高置信度，但耗时增加；置信度不再上升时继续增加意义不大。
随机种子与模型数
多聚体结果对随机种子较敏感。增加种子数可得到更多候选，AlphaFold-Multimer 按 0.8×ipTM + 0.2×pTM 排序；应观察多个高分模型的界面是否一致，而不是只取第一名。
序列范围与拆分
长序列会显著增加显存占用和运行时间。可以按结构域拆分预测以获得更好的局部模型，但结构域之间的相对位置仍需全长预测结合 PAE 来判断。
化学计量比
输入几个拷贝，模型就会尝试组装成几聚体，拷贝数错误时也可能得到看似合理的结构。拷贝数应以分子排阻色谱、交联质谱或文献为依据。
常见错误
- 把 pLDDT 低于 50 的区域当作真实构象：这类区域多为内在无序区或预测失败，常呈伸展的带状，不能用来讨论二级结构或相互作用。
- 只用 pLDDT 评价多结构域蛋白：每个结构域 pLDDT 都高，不代表结构域之间的摆放正确，相对位置必须结合 PAE 判断。
- 预测点突变体后与野生型对比，得出突变破坏结构的结论：模型对单点突变几乎不敏感，两者结构差异不能反映真实的稳定性变化。
- 复合物模型出现界面就认定两个蛋白直接结合：ipTM 低或界面 PAE 高时界面不可信；即使分数高也只是假说，需要实验验证。
- 把带长无序尾巴的模型直接用于对接或分子动力学：低置信度区域可能遮挡口袋，或在模拟中大幅摆动，干扰 RMSD 和结合分析。
- 在预测的无配体结构上对接时忽略口袋构象：侧链朝向可能不适合配体进入，应与同家族已知配体复合物结构对照。
结果怎么看
pLDDT 着色结构图
每个残基 0–100 的置信度，保存在 PDB 文件的 B-factor 列。常用分档：90 以上很高，70–90 主链通常可靠，50–70 偏低，50 以下多为无序。重点看活性位点和突变位点落在哪一档。
PAE 矩阵热图
横纵轴都是残基编号，每格表示以一个残基对齐时另一个残基位置的预期误差（Å）。对角线上的低误差方块对应结构域；方块之间误差低说明结构域相对位置可信，误差高说明摆放不确定。
pTM 与 ipTM 分数
pTM 评价整体折叠，ipTM 评价链间界面。常用经验是 ipTM 高于 0.8 的复合物预测较可信，低于 0.6 多半失败，中间为灰区，需要结合界面 PAE 和多个种子的一致性判断。
多模型叠合图
把同一目标的多个模型叠合。高置信区域应高度重合；如果核心区在不同模型间差异明显，或界面在不同种子间换了位置，说明预测不稳定，不宜作为确定结论。
结构质量报告
包括 Ramachandran 有利区比例、clashscore 和异常旋转异构体比例。弛豫后仍有大量冲突或异常主链二面角，说明该区域模型质量差，通常与低 pLDDT 区域重合。
和相近方法怎么选
AlphaFold2 与 ESMFold
AlphaFold2 依赖 MSA，对有足够同源序列的蛋白精度通常更高；ESMFold 只需单条序列，速度快很多，适合宏基因组蛋白或大规模批量预测。需要单个目标的精细结构时，优先用 AlphaFold2，或用它复核 ESMFold 的结果。
AlphaFold-Multimer 与 AlphaFold3
AlphaFold-Multimer 面向蛋白多聚体；AlphaFold3 改用扩散式结构模块，可同时处理蛋白、核酸、小分子配体和离子。只有蛋白链时两者均可，涉及核酸或配体时需要 AlphaFold3 一类模型，其参数需申请且限非商业用途。
深度学习预测与同源建模
SWISS-MODEL、MODELLER 等同源建模依赖模板的序列一致性，有高一致性模板时结果可靠且构象接近模板；缺少合适模板时深度学习方法优势明显。需要指定某个构象（如某个结合态）时，用该构象做模板的同源建模反而更可控。
预测结构与实验结构
实验结构反映特定条件下的真实构象，包含配体、辅因子和结构水信息；预测模型通常不含这些，对柔性区也给不出可靠构象。两者都有时以实验结构为准，预测结构用来补全实验结构中缺失的片段。
常见问题
AlphaFold 的 pLDDT 多少才算可信？
常用分档是：90 以上主链和侧链都较可靠，70–90 主链折叠通常可靠，50–70 只能参考大致走向，50 以下多为无序区。判断时要看你关心的具体区域，而不是全蛋白平均值；多结构域蛋白还要结合 PAE 判断结构域间的相对位置。
AlphaFold 预测的结构能直接用来做分子对接吗？
可以作为起点，但要先检查口袋区域 pLDDT 是否较高，截去低置信度的柔性末端。预测模型不含配体，口袋侧链可能处于不利于结合的构象，建议用同家族已知配体做重对接测试，必要时用分子动力学采样多个口袋构象。
AlphaFold 能预测点突变后的蛋白结构吗？
能运行，但结果通常和野生型几乎一样，因为模型主要依据进化信息，对单个残基替换不敏感。评估错义突变的影响更适合结合突变位点的空间位置、保守性、稳定性预测工具和实验数据，而不是比较两个预测模型的差异。
预测的蛋白复合物结构可信吗？
先看 ipTM 和链间 PAE。ipTM 高、界面 PAE 低、多个随机种子给出一致界面时可信度较高；ipTM 低于约 0.6 或界面在不同模型间变化，基本不能采用。即使分数高，结合关系本身仍需免疫共沉淀、交联或突变实验验证。
AlphaFold 数据库里已经有结构，还需要自己预测吗？
单体且序列与数据库条目一致时，直接下载即可。以下情况需要自己预测：研究的是截短体、融合蛋白或突变构建体；需要同源或异源多聚体；需要加入核酸、配体等其他分子；或者想用多个种子评估结构的不确定性。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 里，你给出序列、UniProt 编号或 FASTA 文件，说明要预测单体、同源多聚体还是含核酸或配体的复合物。Codar 先确认链组成和拷贝数，再运行相应的结构预测并做结构质量评估。交付结构文件、pLDDT 着色图、PAE 热图、pTM 与 ipTM 汇总表、质量报告和可复现脚本。
我有一个没有实验结构的蛋白序列（附 FASTA），想预测它的同源二聚体结构，评估 ipTM 和界面 PAE，并标出 pLDDT 低于 70 的区域。