蛋白质设计：逆折叠与结合蛋白生成
蛋白质设计要回答两类问题。一类是逆折叠：骨架结构已知，问哪些序列能折叠成这个形状，代表方法是基于图神经网络的 ProteinMPNN，它按每个位点的局部几何环境预测残基概率。另一类是从头生成：先用扩散模型（如 RFdiffusion）围绕目标表位生成全新骨架，再用逆折叠配序列，得到自然界不存在的结合蛋白或支架。也有直接在全原子层面生成蛋白与配体、核酸复合物的方法。典型输入是一个结构文件和要保留或重设计的位点，输出是大量候选序列，需经结构预测回验与打分筛选后再进实验。
什么时候用
- 已有骨架结构，希望重新设计序列以提高稳定性或表达量
- 针对已知表位设计全新的小蛋白结合剂作为工具分子
- 固定关键功能残基，重设计其余部分形成新支架
- 设计对称寡聚体、纳米笼等具有特定几何形状的组装体
- 为抗体或纳米抗体的 CDR 区域生成候选序列再筛选
不适合的情况
- 靶点没有结构也无可靠预测模型：无法定义设计界面
- 期望计算直接给出可用的高亲和力分子：候选需要实验验证，成功率有限
- 只想做几个点突变评估影响：用突变效应预测更直接
需要准备的数据
- 骨架或靶点结构
- PDB 或 mmCIF 文件，链和残基编号清晰；实验结构优先，预测结构需检查目标区域置信度
- 设计位点定义
- 需要重设计的残基列表、必须固定的功能残基，以及链的设计或不设计标记
- 表位或热点残基
- 设计结合蛋白时指定靶点上的目标表位残基，用于引导骨架生成朝向该区域
- 几何或长度约束
- 设计骨架的长度范围、二级结构偏好、对称性设置，以及是否需要保留配体结合口袋
- 配体或核酸信息（可选）
- 做全原子复合物设计时需要配体结构与化学信息，并确认其在结构中的坐标正确
分析步骤
- 1
准备与清理结构
补齐缺失侧链、处理多构象和非标准残基，保留需要的配体和金属离子。检查链编号与后续设计位点列表一致，残基编号错位是最常见的设计失败原因。
- 2
定义设计任务
明确固定残基与可设计残基：催化残基、二硫键、与配体直接接触的残基通常固定。设计结合蛋白时，标出表位残基和期望的接触方向，并确定新链的长度范围。
- 3
生成骨架（从头设计）
用扩散类方法围绕表位生成大量候选骨架，常设置不同长度和二级结构倾向以增加多样性。先检查骨架是否有明显断裂、碰撞或不合理的长 loop，再进入下一步。
- 4
逆折叠生成序列
对每个骨架用 ProteinMPNN 等方法采样多条序列，常见做法是每个骨架取几条到几十条。查看各位点的概率分布，界面残基概率过于分散通常意味着骨架在该处几何不理想。
- 5
回折叠验证
用 AlphaFold2 单序列模式或 ESMFold 对每条设计序列独立预测结构，与设计骨架对齐计算自一致性 RMSD，同时记录 pLDDT 和复合物的 PAE 或 ipTM。这一步是过滤的主力。
- 6
打分与排序
综合自一致性 RMSD、预测置信度、界面接触面积和埋藏情况、界面极性互补性等指标排序。可再用物理打分或短时间分子动力学检查界面是否稳定。
- 7
筛选与实验衔接
剔除富含疏水暴露面、含大量连续同种残基、糖基化或蛋白酶位点异常的序列，并保证入选序列在序列和骨架上具有多样性，再做密码子优化进入表达与结合实验。
关键参数与决策
采样温度
逆折叠采样温度控制序列多样性。较低温度（如 0.1）给出接近最优的保守序列，较高温度增加多样性但风险更大。常见做法是在低温下取主力候选，再用较高温度补充多样性。
固定残基集合
固定太多残基会限制设计空间，使序列难以兼容骨架；固定太少则可能丢失功能。通常固定催化位点、关键结合残基和维持折叠的核心残基，并在设计后确认它们未被改动。
热点残基与表位定义
指定的表位残基决定设计朝哪个方向生长。表位选在平坦且缺乏凹陷的区域时成功率较低，优先选择有口袋或凸起、可形成多点接触的表位。
设计数量
从头结合蛋白设计的实验成功率通常较低，因此一般生成成千上万候选，再层层过滤到几十到几百个做实验。候选太少时过滤后可能没有合格序列。
自一致性阈值
常用经验标准是设计序列的预测结构与设计骨架的骨架 RMSD 小于约 2 Å，且 pLDDT 较高、界面 PAE 较低。阈值应根据任务难度调整，并在报告中说明。
常见错误
- 直接把设计序列送去实验而不做回折叠验证：逆折叠只保证局部环境匹配，大量序列实际折不成目标结构。
- 用 AlphaFold2 配合多序列比对验证从头设计：设计序列没有真实同源序列，MSA 会引入误导，验证应使用单序列模式或 ESMFold。
- 设计位点编号与结构文件不一致：导致固定残基没被固定或设计了错误区域，结果看似合理却偏离目标。
- 表位选在高度柔性的 loop 上：靶点局部构象不确定，设计界面在实验中难以复现。
- 只按一个打分指标排序：单一指标容易被钻空子，应同时看自一致性、界面指标和序列合理性。
- 忽略可开发性：设计序列中大片疏水暴露、连续多个相同残基或引入非预期半胱氨酸，会导致表达困难或聚集。
结果怎么看
候选序列表
每行一条设计序列，附来源骨架、采样温度、逆折叠得分。检查同一骨架的多条序列是否高度相似，若几乎一致说明采样多样性不足，可提高温度或增加骨架数。
回折叠对比图
设计骨架与预测结构的叠合图，并标出 RMSD。骨架整体贴合而只有末端 loop 偏离通常可接受；界面区域偏离明显则该设计不可信，即使整体 RMSD 较小。
筛选指标散点图
常以自一致性 RMSD 为横轴、pLDDT 或界面得分为纵轴，标出阈值分界。理想候选聚在低 RMSD、高置信度一角；若几乎没有点落入该区域，需要回到骨架生成阶段调整表位或长度。
界面接触分析
列出设计蛋白与靶点之间的氢键、盐桥、埋藏面积和接触残基，并与天然复合物的典型范围比较。界面主要靠少数疏水接触、缺少极性互补时，特异性通常较差，也更容易脱靶。
和相近方法怎么选
逆折叠与从头骨架生成
逆折叠要求已有骨架，只解决序列问题，计算量小、成功率相对高，适合稳定化和重设计。从头生成同时产生新骨架和新界面，可以针对任意表位，但候选数量需求大、实验成功率低，两者通常串联使用。
ProteinMPNN 与蛋白语言模型
ProteinMPNN 基于结构几何预测残基，设计的序列与给定骨架高度兼容。ESM 等语言模型从序列统计出发，更适合评估突变效应或生成同家族变体。结构明确时用逆折叠，只有序列时用语言模型。
从头设计与抗体亲和力成熟
从头设计不依赖已有抗体，可针对难以免疫的表位，但要从零建立界面。亲和力成熟在已有结合分子基础上做局部优化，起点好、周期短，但受限于原有结合模式和表位。
序列设计与全原子复合物设计
常规逆折叠只处理蛋白主链环境，不显式考虑小分子或核酸。全原子设计方法能把配体、核酸一起纳入生成过程，适合设计配体结合口袋，但对输入配体构象和参数的准确性更敏感。
常见问题
ProteinMPNN 设计的序列怎么验证？
标准做法是自一致性回折叠：用 AlphaFold2 单序列模式或 ESMFold 预测设计序列的结构，与设计骨架对齐算 RMSD，常以小于约 2 Å 且置信度高作为经验门槛。再结合界面指标和序列合理性筛选。
从头设计结合蛋白需要生成多少候选？
公开报道的从头结合蛋白实验命中率普遍较低，因此通常生成数千到数万个骨架-序列组合，经计算过滤后挑选几十到几百个做实验。具体数量取决于表位难度和可承担的实验通量。
设计时为什么不能用 MSA 做验证？
从头设计序列在自然界没有同源序列，检索得到的 MSA 要么为空要么是噪声。有 MSA 时 AlphaFold2 可能主要依据同源信息给出高置信结构，掩盖设计序列本身的问题，所以验证要在单序列条件下做。
怎么选结合的表位？
优先选功能相关、表面可及、有凹陷或凸起可形成多点接触的区域，避免高度柔性的 loop、糖基化密集区和与其他蛋白重叠的区域。表位的平坦程度在很大程度上决定设计难度。
固定残基和设计残基怎么划分？
一般固定催化残基、金属配位残基、与配体直接接触的残基以及维持折叠的核心残基，其余表面和界面残基开放设计。划分后要用结构可视化确认固定集合覆盖了功能位点，并在设计结果中核对未被改动。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 中提供结构文件并说明设计目标，它会先确认方案：固定哪些残基、表位如何定义、设计长度与候选数量、采样温度和筛选阈值。随后做序列逆折叠设计或结合蛋白生成设计，必要时进行全原子蛋白与复合物设计，再对候选做回折叠验证、界面分析和多指标排序。交付候选序列表、叠合对比图、筛选指标表和可复现脚本。
我有靶蛋白的晶体结构，想在它某个表位上设计一批小蛋白结合剂，帮我生成骨架和序列，并用回折叠筛出最可信的 50 个候选。