基因组组装与质量评估（hifiasm、BUSCO）
基因组从头组装是在没有参考基因组、或参考基因组与研究材料差异很大时，直接用测序读段拼出物种的染色体序列。现在主流做法是用 PacBio HiFi 或 Nanopore 长读长组装出 contig，再借助 Hi-C 数据把 contig 排序定向挂到染色体上，必要时用短读长或 HiFi 做纠错。hifiasm 适合 HiFi 数据，能直接输出主组装或两套单倍型；Flye、NextDenovo 常用于 Nanopore 数据。组装完成后要从连续性（contig N50、contig 数）、完整性（BUSCO、k-mer 完整度）和准确性（QV、错误组装）三方面评估，再进入基因组注释和比较基因组分析。
什么时候用
- 研究的物种没有参考基因组，或现有参考质量差、碎片化严重
- 需要品种或个体特异的高质量基因组，做结构变异或泛基因组比较
- 高杂合物种，希望得到两套单倍型分辨的组装
- 细菌、真菌等小基因组，用长读长一次拼出完整染色体和质粒
- 已有组装版本，需要用 BUSCO、QV 等指标评估或与新版本对比
不适合的情况
- 已有高质量参考基因组、只想检测 SNP 或小 InDel：直接比对到参考做变异检测更合适
- 只有低深度短读长数据却期望染色体级组装：重复区和长片段无法跨越，结果高度碎片化
- 混合多个个体或严重污染的样本直接组装：单倍型和物种来源会混在一起
需要准备的数据
- 长读长数据
- HiFi 或 Nanopore 的 BAM、FASTQ；读长和深度决定组装上限，需先统计读长 N50 和总量。
- Hi-C 数据
- 双端 FASTQ，用于染色体挂载或辅助 hifiasm 分型；需与组装样本来自同一个体或同一材料。
- 短读长数据
- Illumina 双端数据，可选，用于 k-mer 估计基因组大小、Merqury 评估或纠错。
- 物种背景信息
- 预估基因组大小、倍性、近缘物种参考，决定 BUSCO 谱系选择和组装结果是否合理。
分析步骤
- 1
基因组 survey
用 Jellyfish 或 KMC 统计短读长或 HiFi 的 k-mer 频数，再用 GenomeScope 拟合，估计基因组大小、杂合度和重复比例。拟合曲线和观测频数吻合，出现清晰的杂合峰和纯合峰，说明估计可信。
- 2
读段质控
统计长读长读长分布和总深度，去除过短读段和明显污染。HiFi 读段本身质量高，一般不需要额外纠错；Nanopore 数据要关注碱基识别模型版本，旧模型数据的错误率明显更高。
- 3
contig 组装
HiFi 数据用 hifiasm，Nanopore 数据常用 Flye 或 NextDenovo。组装总长应接近 survey 估计值；明显偏大往往是杂合区两份单倍型都被保留，明显偏小提示深度不足或重复区塌缩。
- 4
去冗余与纠错
对主组装中残留的冗余单倍型片段可用 purge_dups 按覆盖度去除。Nanopore 组装通常再用 Medaka 或短读长做纠错；HiFi 组装一般不需要额外纠错，过度纠错反而可能引入错误。
- 5
Hi-C 挂载
将 Hi-C 读段比对到 contig 上，用 YaHS、3D-DNA 等工具排序定向，形成染色体级 scaffold。在 Juicebox 中查看互作热图，对角线连续、没有错位的方块，说明挂载基本正确，再人工修正明显的错接。
- 6
污染筛查
用 BLAST、NCBI FCS 或 BlobToolKit 按序列来源、GC 和覆盖度检查 contig，去除细菌、真菌、宿主或线粒体叶绿体冗余片段。提交公共数据库前这一步通常是必需的。
- 7
质量评估
统计 contig 和 scaffold N50、数量和总长；用 BUSCO 评估保守单拷贝基因的完整性；用 Merqury 基于 k-mer 计算 QV 和完整度。几项指标结合起来，才能判断组装是否可用于注释和比较分析。
关键参数与决策
数据类型与组装软件
HiFi 读段准确率高，hifiasm 是常用选择；Nanopore 读段更长但误差更高，常用 Flye、NextDenovo，必要时纠错。两者都有时，可考虑 hifiasm 超长读长模式或 Verkko。
测序深度
HiFi 组装常按单倍型 20× 到 30× 以上准备数据，Nanopore 常准备更高深度，这些都是经验值。深度不足时 contig 会在重复区断开，单倍型分型也会不完整。
单倍型分型方式
只有 HiFi 时 hifiasm 输出主组装和备选组装；加入 Hi-C 或亲本短读长后可得到两套分型单倍型。研究等位基因差异、杂种优势时需要分型组装，只做常规注释可用主组装。
BUSCO 谱系数据集
选与物种最接近、基因数较多的谱系，例如哺乳动物用 mammalia，植物可选 embryophyta 或更细的科级数据集。谱系选得过宽，完整性高但区分度低；选错谱系会得到偏低的误导性结果。
去冗余力度
purge_dups 依据覆盖度判断冗余片段，阈值根据读段深度直方图自动或手动设定。去冗余不足 BUSCO 重复率偏高，去得过度会把真实的重复基因区一起删掉，导致完整性下降。
常见错误
- 只看 contig N50 判断组装好坏：错误组装把不相邻片段拼在一起也会抬高 N50，必须结合 BUSCO、QV 和 Hi-C 热图判断。
- BUSCO Duplicated 比例很高却不处理：多数是杂合区两套单倍型同时保留，会让基因家族扩张、拷贝数分析得出错误结论。
- 高杂合或多倍体物种按二倍体默认参数组装：等位片段被当成不同序列或被错误塌缩，组装大小和 BUSCO 结果都会异常。
- Hi-C 样本与组装样本不是同一个体：互作信号与组装序列不匹配，挂载出现大量错接，热图出现离对角线的强信号块。
- 跳过污染筛查直接注释：混入的微生物 contig 会产生大量异常基因，并在比较基因组中被误读为水平转移。
- 对 HiFi 组装反复用短读长纠错：短读长在重复区比对不准，可能把正确的碱基改错，反而降低 QV。
结果怎么看
GenomeScope k-mer 拟合图
横轴是 k-mer 覆盖度，纵轴是频数。二倍体常见两个峰，左峰是杂合 k-mer，右峰是纯合 k-mer；左峰越高杂合度越高。模型拟合差或峰不清晰，说明深度不足或样本存在污染、多倍体。
组装统计表
列出 contig 和 scaffold 的数量、总长、N50、最长序列。总长与 survey 估计值相差过大需要追查原因；挂载后大部分序列应落在与染色体数相当的 scaffold 上。
BUSCO 结果
分为 Complete（Single 和 Duplicated）、Fragmented、Missing 四类。高质量组装完整比例高；Duplicated 异常高指向冗余单倍型未去除，Fragmented 多指向碱基错误或碎片化。
Hi-C 互作热图
每个染色体呈现沿对角线的强信号方块。离对角线的强信号块提示错接或易位，方块内部出现反向的信号带提示片段方向错误，需要在 Juicebox 中手动调整。
Merqury QV 与 k-mer 谱图
QV 越高碱基准确率越高，QV 40 对应约万分之一错误率。谱图中只出现在读段、不出现在组装中的 k-mer 代表缺失序列；组装中多拷贝 k-mer 过多提示冗余。
和相近方法怎么选
hifiasm 与 Flye
hifiasm 面向 HiFi，分型能力强，可结合 Hi-C 或亲本数据输出两套单倍型；Flye 面向误差较高的长读长，对 Nanopore 适用面广。以 HiFi 为主选 hifiasm，以 Nanopore 为主选 Flye 或 NextDenovo。
BUSCO 与 Merqury
BUSCO 用保守单拷贝基因评估基因区完整性，不需要原始读段，但只覆盖基因组中很小一部分；Merqury 用读段 k-mer 评估整个基因组的完整度和准确性，需要高质量短读长或 HiFi。两者互补，正式报告通常同时给出。
从头组装与参考比对
从头组装能发现参考中缺失或重排的序列，但成本高、耗时长；比对到参考检测变异快而便宜，却看不到参考中不存在的序列。已有近缘高质量参考且只关心小变异时，比对更合适。
常见问题
BUSCO 完整度多少算合格？
没有统一门槛，与物种、谱系数据集和测序数据有关。高质量长读长组装在合适的谱系下完整比例通常很高，明显偏低时先检查谱系是否选对、组装是否碎片化或存在大量碱基错误，再与近缘物种已发表组装对比。
hifiasm 输出的哪个文件是最终组装？
hifiasm 输出 GFA 格式的图，常用的是主 contig 文件（文件名含 p_ctg）；分型模式下还有 hap1、hap2 两套单倍型文件。GFA 需要转换为 FASTA 后才能用于 BUSCO、挂载和注释。
组装大小比 survey 估计大很多怎么办？
最常见的原因是杂合区两份单倍型都留在了主组装里，可通过 BUSCO Duplicated 比例和覆盖度分布确认，然后用 purge_dups 去冗余。另一个原因是污染序列，需要做来源筛查。survey 本身在高重复基因组中也可能低估大小。
一定要做 Hi-C 挂载吗？
只用于基因预测和基因家族分析时，contig 级组装也可以使用。做共线性、染色体结构变异、着丝粒端粒分析或发表染色体级基因组时，需要 Hi-C 或遗传图谱把 contig 挂到染色体上。
Contig N50 和 Scaffold N50 有什么区别？
Contig 是连续无间隙的序列，scaffold 是由 contig 按顺序方向连起来、中间可能有 N 填充的序列。Contig N50 反映组装本身的连续性，scaffold N50 主要反映挂载效果，两者都应报告。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 里说明物种、预估基因组大小和手上的数据类型后，会先确认组装方案，再按 HiFi 或 Nanopore 数据选择长读长从头组装流程生成 contig 级组装，并做质控评估，统计 contig 数、总长、N50 和 BUSCO 完整性。交付组装 FASTA、组装统计表、BUSCO 结果图表、分析报告和可复现脚本。
我有一个二倍体植物的 HiFi 数据约 40×，预估基因组 800 Mb，想做从头组装，并用 BUSCO 评估完整度