Hi-C 分析：A/B 区室、TAD 与染色质环
Hi-C 通过交联、酶切、连接和测序，捕获全基因组范围内任意两段 DNA 在三维空间中的接触频率，结果是一张按固定区间（bin）划分的接触矩阵。从这张矩阵可以读出三个层级的结构：兆碱基尺度的 A/B 区室（A 区室多为开放、活跃染色质，B 区室多为封闭染色质）；数十到数百 kb 的拓扑关联结构域（TAD），域内接触频繁、跨边界接触少；以及更精细的染色质环，常见于 CTCF 结合位点之间或增强子与启动子之间。Micro-C 用 MNase 替代限制性内切酶，分辨率更高；HiChIP 和 Capture Hi-C 则富集特定蛋白或区域的互作。Hi-C 常用于研究基因调控的三维机制、肿瘤结构变异和细胞分化中的染色质重塑。
什么时候用
- 想知道某个远端增强子是否与目标基因启动子发生物理接触
- 比较两种细胞状态或处理前后 A/B 区室切换和 TAD 边界变化
- 研究 CTCF、cohesin 等结构蛋白缺失后染色质环的丢失或形成
- 解释非编码区 GWAS 变异或结构变异可能影响的靶基因
- 在肿瘤样本中辅助识别易位等大尺度结构变异
不适合的情况
- 测序深度较低却希望在千碱基级分辨率检测染色质环
- 样本量很少的原代细胞，Hi-C 文库复杂度不足，重复率过高
- 只关心某几个位点的互作，此时 Capture Hi-C 或 4C 成本更低、信号更强
需要准备的数据
- 双端 FASTQ
- Hi-C 或 Micro-C 原始测序数据，需记录使用的限制性内切酶或 MNase，决定酶切片段文件和过滤规则。
- 参考基因组
- 与其他组学数据一致的版本，并准备染色体大小文件；酶切法需由基因组生成酶切位点文件。
- 已有接触矩阵
- 若跳过上游，可直接提供 .hic 或 .mcool 文件，需确认已包含的分辨率和是否已做平衡。
- 辅助表观数据
- CTCF、H3K27ac ChIP-seq 或 ATAC-seq 峰，用于判断环锚点、注释增强子-启动子互作，并确定区室方向。
分析步骤
- 1
比对与互作对提取
双端读段分别比对到基因组，Hi-C 读段常跨越连接点，需要能处理嵌合比对的流程，如 HiC-Pro、Juicer 或 distiller 结合 pairtools。输出每个读段对的两个比对位置和类型。
- 2
过滤与质控
去除 PCR 重复、自连接、悬挂末端等无效对，统计有效互作对比例、cis/trans 比例、远距离 cis 比例和重复率，并绘制接触概率随距离衰减的 P(s) 曲线。同一实验不同重复的 P(s) 曲线应基本重合。
- 3
构建并平衡矩阵
按多个分辨率生成接触矩阵，存为 .mcool 或 .hic，再用 ICE 或 KR 方法平衡，消除不同区域可比对性和酶切位点密度造成的覆盖偏差。平衡后各 bin 的行和应大致一致。
- 4
识别 A/B 区室
在较粗分辨率下计算观测/期望矩阵的相关矩阵，取第一主成分作为区室特征值，再按 GC 含量或基因密度确定正负号，使正值对应 A 区室。用鞍形图评估区室分离强度。
- 5
识别 TAD 与边界
在中等分辨率下计算绝缘分数，局部极小值即边界；也可用方向性指数、Arrowhead 或 TopDom。在热图上叠加 TAD 调用结果，看三角形结构是否与调用一致，并检查边界处是否富集 CTCF 峰。
- 6
检测染色质环
在较高分辨率下用 HiCCUPS、Mustache、cooltools dots 或 Chromosight 识别点状富集信号，再用聚合峰分析（APA）检验整体环信号强度。锚点上 CTCF 基序常呈相向排列，可作为结果合理性的检查。
- 7
注释增强子-启动子互作
把环锚点或显著互作与启动子、增强子标记重叠，筛选一端为启动子、另一端为活性增强子的互作，并结合表达数据判断目标基因。HiChIP 或 Capture Hi-C 数据可用 FitHiC2、CHiCAGO 等调用显著互作。
- 8
样本间比较
比较前将样本下采样到相同有效互作对数，或使用考虑深度的差异方法。区室比较看特征值翻转区域，TAD 比较看绝缘分数差值，环比较可用 diffHic、multiHiCcompare 等方法，并要求生物学重复。
关键参数与决策
分辨率选择
区室分析常用 100 kb 至 1 Mb，TAD 常用 10 至 50 kb，染色质环需要 5 至 10 kb 甚至更细，均为经验范围。分辨率能否支撑取决于深度：放大到该分辨率后大多数 bin 应有足够接触数，否则结果噪音很大。
矩阵平衡方法
ICE（cooler balance）和 KR（Juicer 中常用）都是迭代矩阵平衡，结果相近。低覆盖 bin 平衡时会被设为缺失，应检查被过滤的 bin 是否集中在某些染色体区域，例如着丝粒和重复区。
区室特征值方向
主成分的正负号是任意的，不同染色体、不同样本间可能相反。需要用 GC 含量、基因密度或活性标记的相关性统一方向，否则比较样本时会把方向翻转误判为大量区室切换。
绝缘分数窗口
窗口通常设为分辨率的若干倍。窗口小对小 TAD 敏感但噪音大，窗口大边界更稳定但会漏掉小结构。可在多个窗口下计算，选择边界数和边界强度都稳定的设置。
环检测的显著性与最小距离
靠近对角线的接触本身很强，需要设定最小环跨度，避免把局部高接触误判为环。显著性阈值宜结合 APA 信号评估，宁可少报也不要把大量弱点当作环。
常见错误
- 分辨率超出测序深度：在深度不足的数据上用 5 kb 调用环，得到的大多是噪音点，不同重复间几乎不重叠。
- 区室特征值不统一方向：未用 GC 含量或基因密度校正正负号，会把整条染色体错误标为 B 区室，或在样本比较中出现虚假的区室切换。
- 不同深度直接比较 TAD 数量：深度越高检测到的边界越多，未下采样就比较，会把深度差异误当成染色质结构变化。
- 忽略拷贝数变异和易位：肿瘤细胞系中扩增区接触整体升高，易位在热图上表现为跨染色体高信号块，容易被误读成特殊互作。
- 把 TAD 内共存当作增强子调控证据：同在一个 TAD 只说明接触机会较高，判断具体靶基因还需要环、活性标记或扰动实验支持。
结果怎么看
QC 汇总与 P(s) 曲线
表中看有效互作对比例、cis/trans 比例和重复率；P(s) 曲线呈随距离下降的幂律形态。cis 比例明显偏低、trans 偏高常提示连接效率差或随机连接多，这样的文库不适合做精细分析。
接触热图
对角线附近的三角形为 TAD，远离对角线的棋盘格为区室，离散的亮点为染色质环。查看关心区域时同时展示平衡后的矩阵和 ChIP 或 ATAC 轨道，方便判断结构与调控元件的对应。
区室特征值轨迹与鞍形图
轨迹上正值为 A、负值为 B，应与基因密度和活性标记一致。鞍形图左上和右下角（AA、BB）偏亮、另两角偏暗，说明区室分离良好；分离强度降低常见于某些处理或衰老状态。
绝缘分数与边界列表
绝缘分数低谷即边界，边界强度越大越明显。比较两样本时看差值显著的边界是否在重复中一致，并检查边界处是否伴随 CTCF 结合变化。
染色质环列表与 APA 图
环列表包含两个锚点坐标和显著性。APA 图中心像素明显亮于周围说明整体环信号真实；中心不突出则说明调用的环多为噪音。锚点与启动子、增强子的重叠情况用于筛选调控候选。
和相近方法怎么选
Hi-C 与 HiChIP、Capture Hi-C
Hi-C 无偏覆盖全基因组，能同时看区室、TAD 和环，但要获得高分辨率需要很高深度；HiChIP 富集特定蛋白（如 H3K27ac）相关的互作，Capture Hi-C 富集选定区域，在较低深度下就能得到这些位点的高分辨率互作，但看不到全局结构。
Hi-C 与 Micro-C
Micro-C 用 MNase 将染色质切到核小体级片段，接触图分辨率更高，能更清楚地识别精细的环和启动子间互作；Hi-C 依赖酶切位点分布，分辨率受限但流程更成熟。两者下游分析工具基本通用。
TAD 调用工具之间
绝缘分数类方法简单稳定、适合样本比较；方向性指数适合粗分辨率；Arrowhead 可识别嵌套结构但对深度要求高。不同工具调用的 TAD 重叠度有限，比较样本时应使用同一工具和同一参数。
常见问题
Hi-C 需要测多深？
取决于目标分辨率。区室分析对深度要求最低，TAD 次之，千碱基级的染色质环要求最高。没有统一硬门槛，常见做法是参考同物种、同实验方法的已发表数据，并在拿到数据后检查目标分辨率下 bin 的接触数分布是否足够。
TAD 和 A/B 区室有什么区别？
区室是兆碱基尺度的分区，同类区室在全染色体范围内相互接触，反映活跃与非活跃染色质的分隔；TAD 是数十到数百 kb 的局部结构域，通常由 cohesin 环挤出和 CTCF 边界形成。两者形成机制不同，在热图上也表现为棋盘格与三角形两种模式。
.hic 和 .mcool 文件有什么区别？
.hic 是 Juicer 生态的格式，可直接在 Juicebox 中查看；.mcool 是 cooler 的多分辨率格式，基于 HDF5，被 cooltools、HiGlass 等 Python 工具使用。两者都存多分辨率矩阵，可用 hic2cool 等工具互转。
如何用 Hi-C 判断增强子调控哪个基因？
先在增强子所在区域查看是否存在与某个启动子之间的显著环或互作，再结合 H3K27ac、ATAC 判断增强子活性，并看该基因表达是否与增强子活性一致。三维接触只是必要条件之一，确定调控关系最好用 CRISPRi 抑制增强子观察基因表达变化。
Hi-C 质控看哪些指标？
主要看有效互作对比例、PCR 重复率、cis 与 trans 比例、远距离 cis 比例和 P(s) 衰减曲线。cis 比例高、远距离 cis 占比合理、重复率低、重复间 P(s) 曲线一致，说明文库质量较好，可以支撑较高分辨率分析。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 中提供 Hi-C FASTQ 或现成的 .hic、.mcool 文件以及辅助的 CTCF、H3K27ac 峰后，会先确认酶切方式、基因组版本和目标分辨率，再完成 Hi-C 数据处理与质量控制、A/B 区室和 TAD 分析、染色质环检测与增强子-启动子互作注释，以及样本间比较。交付 QC 汇总、接触热图、区室轨迹、TAD 边界与环列表和可复现脚本。
我有对照和 CTCF 敲降两组 Hi-C 数据，每组两个重复，想比较 TAD 边界和染色质环的变化，重点看 MYC 附近的增强子-启动子互作。