增强子与超级增强子识别（ROSE）
增强子是能远距离增强基因转录的调控元件，活性增强子通常带有 H3K27ac 和 H3K4me1 修饰，并处于开放染色质中。超级增强子（super-enhancer）指一类由多个相邻增强子组成、转录激活因子和 H3K27ac 信号异常密集的大区域，常位于决定细胞身份的关键基因和肿瘤驱动基因附近。最常用的识别方法是 ROSE：把彼此相距较近的峰拼接成区域，排除启动子附近的峰，按 ChIP 信号排序，以信号曲线的拐点为界区分超级增强子与普通增强子。识别之后的关键问题是它们调控哪些基因，这需要借助距离、染色质互作、活性与表达相关性等多种证据。典型输入是 H3K27ac、MED1 或 BRD4 的 ChIP-seq 或 CUT&Tag 数据。
什么时候用
- 寻找决定某种细胞身份的核心转录因子及其调控区域
- 在肿瘤中筛选由超级增强子驱动的癌基因，作为 BET 抑制剂等研究的候选
- 比较处理前后或不同亚型间获得或丢失的超级增强子
- 解释位于非编码区的 GWAS 变异是否落在细胞类型特异的强增强子中
- 为远端增强子预测靶基因，挑选 CRISPRi 验证对象
不适合的情况
- 只有 ATAC-seq 而没有活性组蛋白或共激活因子 ChIP，开放区域不等于活性增强子
- ChIP 质量差、峰数很少或无 input 对照，排序曲线没有可靠的拐点
- 拷贝数高度异常的肿瘤样本未做校正，就直接把扩增区当超级增强子
需要准备的数据
- ChIP-seq 比对文件
- H3K27ac、MED1 或 BRD4 的去重 BAM 文件及索引，用于计算区域内信号；样本间应使用相同参考基因组版本。
- Input 对照 BAM
- 用于扣除背景信号；没有 input 会让开放区域和扩增区域的信号虚高，超级增强子排序受影响。
- 峰文件
- MACS2 等工具调用的峰，BED 格式，ROSE 需转为其要求的 GFF 格式；峰的质量直接决定拼接结果。
- 基因注释与表达数据
- 转录起始位点注释用于排除启动子和关联基因；同一细胞的 RNA-seq 有助于筛选真正表达的靶基因。
- 三维互作数据（可选）
- Hi-C、HiChIP 或 Capture Hi-C 数据，可提供增强子与启动子物理接触的证据，用于靶基因关联。
分析步骤
- 1
确认 ChIP 质量
查看 FRiP、峰数、指纹图和已知活性基因位点的信号轨道。H3K27ac 应在活跃基因启动子和远端区域都有清晰峰；信号很弱或峰数异常少时，先解决数据质量再做后续分析。
- 2
定义增强子
以活性标记峰为候选，排除转录起始位点附近的峰作为远端增强子，可结合 H3K4me1、ATAC 或染色质状态注释进一步区分活性与预备态增强子。记录所用启动子窗口大小。
- 3
拼接相邻峰
ROSE 默认把相距 12.5 kb 以内的峰拼接成一个区域；通常再用 -t 2500 排除完全落在转录起始位点上下游 2.5 kb 内的峰。拼接后检查区域长度分布，异常长的区域可能来自大段扩增或广泛修饰。
- 4
排序并找拐点
计算每个拼接区域扣除 input 后的信号，按信号从低到高排序作图，在曲线斜率为 1 的切点处划界，切点以上为超级增强子。查看排在最前面的区域是否包含已知身份基因，作为结果合理性的检查。
- 5
排除拷贝数影响
肿瘤样本中检查超级增强子是否集中在扩增区。可使用拷贝数信息或 input 信号校正，对位于高拷贝区的候选单独标注，并在正文中谨慎解读。
- 6
关联靶基因
先给出最近的表达基因作为基础答案，再用染色质互作、ABC 模型或跨样本的增强子活性与基因表达相关性补充。多种证据一致指向的基因优先，单靠最近距离的结果视为候选。
- 7
比较样本与功能注释
将多样本的超级增强子区域合并，用 DiffBind 等方法在区域上做差异分析，并对靶基因做富集或核心转录调控环路分析。差异结论需要生物学重复支持。
关键参数与决策
拼接距离
ROSE 默认 12.5 kb，是原始研究基于经验选取的值。基因组较紧凑的物种或峰较密的标记可适当缩小。改变拼接距离会改变超级增强子数量和边界，跨样本比较时必须使用相同设置。
启动子排除窗口
常用设置是排除转录起始位点上下游 2.5 kb 内的峰（ROSE 的 -t 参数），避免把高 H3K27ac 的启动子当增强子。不设该参数则不排除；如果有意研究包含启动子的大调控区，要在方法中说明。
用于排序的 ChIP 标记
MED1、BRD4 等共激活因子与转录激活直接相关，H3K27ac 更易获得、使用最广。不同标记识别出的超级增强子重叠较多但不完全相同，比较样本时应使用同一种标记。
靶基因关联窗口与方法
最近基因法简单但常出错；固定窗口内的所有基因能提高召回但降低准确性；ABC 模型结合活性和接触频率打分，更适合全基因组预测。建议同时报告最近基因和基于互作的预测结果。
常见错误
- 不扣除 input 或不处理拷贝数扩增：扩增区内所有信号成倍升高，会被排在前列，导致超级增强子列表混入大量扩增假阳性。
- 把超级增强子数量作为样本间比较指标：拐点阈值依赖信号分布和测序深度，数量差异多半是技术因素，应比较具体区域的信号变化。
- 直接把超级增强子指派给最近基因：增强子常跳过邻近基因调控更远的基因，最近基因法对超级增强子同样容易出错。
- 用不同拼接距离或标记处理不同样本：区域边界和数量会随之改变，样本差异与参数差异无法分开。
- 把超级增强子当作功能已证实的元件：识别只基于信号强度，是否真的调控靶基因、是否比普通增强子更关键，需要扰动实验确认。
结果怎么看
超级增强子排序曲线
横轴为按信号排序的拼接区域，纵轴为信号强度，拐点后陡升的部分为超级增强子。曲线没有明显拐点而是平滑上升，说明信号区分度差，超级增强子与普通增强子的划分不稳定。
超级增强子区域表
列出每个区域的坐标、信号、排名、包含的峰数和关联基因。重点看排名前列区域的关联基因是否为该细胞类型的已知身份基因或驱动基因，并标出位于扩增区的区域。
信号轨道图
在基因组浏览器中展示 H3K27ac、input、ATAC 和基因结构，超级增强子表现为跨越数十 kb 的连续高信号区。input 在同一区域同样升高时，提示扩增或开放染色质造成的假信号。
增强子-靶基因关联表
每对增强子与基因列出距离、ABC 得分或互作强度、表达相关性。多种证据一致的组合可信度最高；只有距离支持而基因不表达的组合应剔除。
和相近方法怎么选
超级增强子与普通增强子分析
普通增强子分析关心每个峰是否为活性增强子以及差异变化，粒度细；超级增强子把相邻峰合并后按总信号排序，突出少数信号最强的调控区，更适合寻找细胞身份基因和癌基因，但会忽略分散的弱增强子。
ROSE 与 HOMER 超级增强子模式
两者核心思路相同，都是拼接峰并按信号排序找拐点。ROSE 是这一方法最常被引用的实现，可直接输出排序曲线和关联基因；HOMER 的 findPeaks 也提供超级增强子模式，便于与其 motif 分析衔接。参数不同会导致结果有差异。
增强子靶基因预测方法
最近基因法零成本但准确性有限；ABC 模型结合增强子活性与染色质接触，适合有 ATAC 和 H3K27ac 的细胞类型；Hi-C 或 HiChIP 提供直接接触证据；跨样本相关性需要较多样本。条件允许时综合使用并以 CRISPRi 验证。
常见问题
超级增强子用什么 ChIP 标记识别？
最常用 H3K27ac，因为抗体成熟、容易获得；最早的研究使用 MED1 和 BRD4 等共激活因子，信号与转录激活更直接相关。BRD4 结合的超级增强子常被用于研究 BET 抑制剂敏感性。同一项研究中样本间应统一使用一种标记。
ROSE 的拼接距离 12.5 kb 必须用默认值吗？
不是必须，但这是最常用的设置，便于与已发表结果比较。如果物种基因组更紧凑或峰更密集，可以试着缩小并检查结果稳定性。修改后应在所有样本中统一，并在方法部分写明。
超级增强子的靶基因怎么确定？
通常先给出邻近且表达的基因，再结合染色质互作数据、ABC 模型打分和跨样本活性-表达相关性筛选，多种证据一致的基因优先。最终确认需要用 CRISPRi 抑制或删除增强子，观察基因表达是否下降。
CUT&Tag 数据可以用 ROSE 识别超级增强子吗？
可以。H3K27ac CUT&Tag 的峰和比对文件同样可输入 ROSE。CUT&Tag 背景低，通常没有传统 input，可用 IgG 对照或不扣除背景，但要注意开放染色质区域的非特异信号，结果最好与 ChIP-seq 或 ATAC 数据对照。
超级增强子分析结果如何验证？
常见做法包括：在独立样本或公开数据中检查是否重复出现；用 BET 抑制剂处理看靶基因是否敏感下降；用 CRISPRi 或删除超级增强子内的关键组分，观察靶基因表达和细胞表型变化。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 中提供 H3K27ac 等 ChIP-seq 或 CUT&Tag 的比对文件、峰文件和对照后，会先确认使用的标记、拼接距离和启动子排除窗口，再完成增强子与超级增强子识别，输出排序曲线和区域表，随后结合表达数据和可用的互作数据完成增强子与靶基因关联。交付超级增强子列表、信号轨道图、增强子-靶基因关联表和可复现脚本。
我有 4 个胃癌细胞系的 H3K27ac ChIP-seq（带 input）和 RNA-seq，想用 ROSE 找超级增强子，并预测它们调控的靶基因。