scATAC-seq 单细胞染色质可及性分析
单细胞 ATAC-seq（scATAC-seq）利用 Tn5 转座酶在单个细胞核中标记开放染色质，得到每个细胞的可及性片段。与单细胞 RNA-seq 相比，它的数据极其稀疏，每个细胞在任一区域通常只有 0、1 或 2 个片段，因此需要专门的处理方式：以片段文件（fragments）为核心，用 TSS 富集分数、片段数和核小体信号做质控，用 TF-IDF 加奇异值分解（即 LSI）降维，按细胞群合并后检测峰，再计算基因活性分数、motif 可及性，并与 scRNA-seq 整合做注释。R 中常用 Signac（基于 Seurat 生态）和 ArchR，Python 中有 SnapATAC2 等。
什么时候用
- 解析组织中各细胞类型的开放染色质图谱和特异调控区
- 识别驱动细胞分化或状态转变的转录因子 motif 活性
- 分析 10x Multiome 数据中同一细胞的 RNA 与 ATAC
- 寻找与 GWAS 风险位点重叠的细胞类型特异增强子
- 在 scRNA-seq 注释基础上比较各细胞群的染色质可及性差异
不适合的情况
- 把 scATAC 当作稀疏的 scRNA 直接做 log 标准化和 PCA，主成分会被深度主导
- 只用公开的批量 ATAC 峰集计数，会漏掉稀有细胞群特有的开放区域
- 仅凭基因活性分数确定细胞类型，未与 RNA 数据或已知 marker 交叉核对
需要准备的数据
- 片段文件
- Cell Ranger ATAC 或 ARC 输出的 fragments.tsv.gz 及索引，记录每个片段的坐标和细胞条形码
- 条形码指标与元数据
- 每个条形码的片段数等指标文件，以及样本、批次、处理分组信息
- 基因组注释与黑名单
- 与比对版本一致的基因注释和黑名单区域，用于计算 TSS 富集和过滤异常信号
- 配对 scRNA-seq（可选）
- 同组织已注释的单细胞转录组，或 Multiome 中的 RNA 部分，用于标签转移注释
分析步骤
- 1
计算质控指标
从片段文件计算每个细胞的唯一片段数、TSS 富集分数、核小体信号、峰内片段比例（FRiP）和黑名单区比例。高质量细胞应有清晰的核小体片段长度周期和较高的 TSS 富集。
- 2
过滤细胞与去双细胞
根据质控分布设阈值，去掉片段数少、TSS 富集低的条形码；用 ArchR 的双细胞评分、AMULET 或 scDblFinder 识别双细胞。过滤后各样本的细胞数和指标分布应大体相近。
- 3
构建特征矩阵
ArchR 默认使用全基因组 500 bp 的 tile 矩阵；Signac 常用 Cell Ranger 峰或自行检测的峰。初始降维阶段使用 tile 或合并峰集，可以避免依赖预先定义的峰。
- 4
TF-IDF 与 LSI 降维
对矩阵做 TF-IDF 标准化后做 SVD。Signac 中常用 RunTFIDF、FindTopFeatures 和 RunSVD；ArchR 用 addIterativeLSI 迭代选择可变特征。检查第一成分是否与片段数高度相关，相关则在后续分析中剔除。
- 5
整合与聚类
多样本时可在 LSI 空间用 Harmony 等方法整合，再构建近邻图做聚类和 UMAP。检查各簇是否由单一样本或低质量细胞组成，避免把技术差异当作细胞类型。
- 6
分群峰检测
按细胞群合并为伪批量，用 MACS2 等工具检测峰，再合并为统一峰集并重新计数。这样能保留稀有细胞群的特异峰，也让各样本使用同一套特征。
- 7
基因活性与注释
根据基因体和启动子区的片段计算基因活性分数，查看 marker 基因；有 scRNA-seq 时用标签转移注释细胞群，并检查各簇预测分数的分布。
- 8
下游调控分析
用 chromVAR 计算每个细胞的 motif 可及性偏差，比较各群间的差异可及峰，或计算峰与基因的关联来推测增强子的靶基因。
关键参数与决策
TSS 富集与片段数阈值
ArchR 创建 Arrow 文件时默认最低 TSS 富集为 4、最低片段数为 1000，可作为起点。组织和实验质量差异大，应依据质控散点图中细胞与背景的分界确定，而不是照搬。
是否去除第一个 LSI 成分
第一成分常与每个细胞的片段数强相关，反映技术深度而非生物差异。Signac 教程中常用 2:30 这类维度范围，前提是先确认这种相关性确实存在。
可变特征数量
LSI 前选取的可变 tile 或峰数会影响分群粒度。特征太少会丢掉稀有群的区分信息，太多会引入噪音，可比较不同数量下聚类结果的稳定性。
峰集来源
Cell Ranger 峰基于全部细胞合并检测，稀有群信号会被稀释；按簇检测峰再合并更全面，但依赖初始聚类的质量，必要时可在注释后重新检测一次。
基因活性定义
不同工具对启动子和基因体窗口的设定不同，ArchR 的基因分数还引入距离加权。基因活性与表达只是相关，不同工具算出的数值不宜直接比较。
常见错误
- 直接用 PCA 处理 scATAC 计数：稀疏近二值数据的方差主要来自深度差异，细胞会按片段数而非细胞类型分开，聚类反映的是技术因素。
- 只按片段数过滤而不看 TSS 富集：片段数高但 TSS 富集低的条形码多为破碎细胞核或背景，常聚成一个难以注释的低质量簇。
- 忽视双细胞：scATAC 中的双细胞表现为两类细胞特征的混合，容易被误认为过渡状态或新的细胞类型。
- 用基因活性代替表达下差异结论：基因活性是表达的粗略近似，许多基因的可及性与表达并不同步，重要结论需要 RNA 数据支持。
- 多样本各自检测峰后直接比较：峰坐标不一致无法对齐，必须先合并成统一峰集并对所有样本重新计数。
结果怎么看
质控散点图
横轴为片段数（对数），纵轴为 TSS 富集分数。高质量细胞集中在右上方，与左下的背景条形码明显分开；两者没有清晰分界时，说明样本质量偏低或细胞核制备有问题。
片段长度分布图
应在 100 bp 以下的无核小体片段和约 200 bp 的单核小体片段处出现峰，并呈周期性。周期消失提示 Tn5 反应条件或细胞核状态异常。
UMAP 与聚类图
每个点是一个细胞，分别按簇、样本和质控指标着色。按样本着色时各簇应包含多个样本的细胞；某个簇的 TSS 富集或片段数整体偏低，可能是低质量细胞群。
基因活性与标签转移
在 UMAP 上展示 marker 基因活性和转移得到的细胞类型及预测分数。预测分数普遍偏低的簇，可能是 RNA 参考中没有的细胞类型，也可能是质量较差的细胞。
差异峰与 motif 偏差热图
行是峰或 motif，列是细胞群。各群特异的 motif 活性应与已知谱系转录因子相符，如髓系细胞中的 CEBP 家族；完全不符时应回查细胞注释。
和相近方法怎么选
ArchR 与 Signac
ArchR 基于磁盘上的 Arrow 文件，内存占用低，适合大规模数据，内置迭代 LSI、双细胞评分和峰-基因关联；Signac 与 Seurat 衔接紧密，便于与 scRNA-seq 及 Multiome 联合分析。已在 Seurat 中工作时选 Signac 更顺手。
scATAC-seq 与批量 ATAC-seq
批量 ATAC 深度高，峰检测和足迹分析更可靠，但混合了所有细胞类型的信号；scATAC 能拆分细胞类型，代价是每个细胞极稀疏。研究异质组织中细胞类型特异的调控时选单细胞。
scATAC-seq 与 scRNA-seq 分析
scRNA 基于表达，降维用标准化加 PCA；scATAC 基于可及性，降维用 TF-IDF 加 LSI，细胞注释常借助 RNA 参考。10x Multiome 能在同一细胞中直接配对两种信息。
chromVAR 与 SCENIC
chromVAR 从染色质可及性角度估计转录因子 motif 活性；SCENIC 基于表达共变和 motif 推断调控子。两者结合，可以从染色质和表达两侧交叉验证同一转录因子的作用。
常见问题
scATAC-seq 质控主要看哪些指标
主要看每个细胞的唯一片段数、TSS 富集分数、核小体信号、峰内片段比例和黑名单区比例。片段数反映深度，TSS 富集反映信噪比，两者需要结合判断。阈值没有统一标准，应根据分布中细胞与背景的分界来设定。
Signac 和 ArchR 怎么选
项目已用 Seurat 处理 scRNA-seq，或要做 10x Multiome 联合分析时，Signac 更方便；样本多、细胞数大、内存有限时，ArchR 的磁盘存储设计更合适。两者核心步骤一致，都是质控、TF-IDF 与 LSI、聚类和峰检测。
为什么 scATAC 用 LSI 而不是 PCA
scATAC 矩阵极稀疏且接近二值。TF-IDF 先校正每个细胞的总片段数，并提高只在少数细胞中开放区域的权重，再用 SVD 降维，这一组合称为 LSI。直接做 PCA 时，主要成分往往由测序深度决定。
基因活性分数能代替基因表达吗
不能完全代替。基因活性根据基因附近的开放程度估计，适合辅助注释和与 RNA 数据整合，但很多基因的染色质开放先于表达或并不伴随表达。重要的表达结论应来自 RNA 数据。
没有配对 scRNA-seq 怎么注释细胞
可以结合已知 marker 的基因活性、细胞类型特异转录因子的 motif 偏差，以及公开的同组织 scRNA-seq 参考做标签转移。跨数据集转移时，要检查预测分数和组织来源是否一致。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 里说明数据来源和样本设计后，会确认物种、参考基因组版本和样本信息，读取本地 Cell Ranger ATAC 输出或下载公开数据；随后完成片段文件读取、TSS 富集与片段数等质控指标计算、低质量细胞和双细胞过滤，以及 TF-IDF 与 LSI 降维，交付质控图、过滤前后统计表、降维结果、可继续分析的数据对象、分析报告和可复现脚本。
我有 2 个小鼠肺组织的 10x scATAC-seq Cell Ranger 输出，帮我做质控过滤和去双细胞，完成 LSI 降维，输出可继续分析的对象