靶向代谢组定量（MRM）
靶向代谢组在实验前就确定要测哪些代谢物，用三重四极杆质谱的多反应监测（MRM，也叫 SRM）对每个代谢物的前体离子和特征碎片离子做专一检测，再借助标准品和内标换算成浓度。它常用于验证非靶向筛出的差异代谢物，或测定氨基酸、有机酸、胆汁酸、短链脂肪酸等通路面板。与非靶向相比覆盖的代谢物少，但灵敏度、线性范围和定量准确度明显更好。典型数据是每样本、每离子对的峰面积，加上浓度已知的校准样本和质控样本，交付带单位的浓度矩阵。
什么时候用
- 验证非靶向代谢组筛出的差异代谢物，需要可靠的定量数值
- 围绕某条通路（如色氨酸-犬尿氨酸、TCA 循环）测一组已知代谢物
- 需要报告绝对浓度并与文献参考范围或其他队列比较
- 大样本队列中对几十到几百个代谢物做高通量定量
- 药物或内源性小分子的浓度测定与药代动力学取样分析
不适合的情况
- 想发现未知或新代谢物：MRM 只能看到事先设定的离子对
- 没有标准品也没有合适内标却要报告绝对浓度：只能给出相对丰度
- 同分异构体无法在色谱上分开且碎片相同：MRM 无法区分，需改方法
需要准备的数据
- 峰面积或原始数据
- 各样本每个离子对的积分峰面积表，或 .wiff、.raw、.d 等原始文件；需包含内标峰面积
- 离子对与保留时间表
- 每个代谢物的前体离子、定量离子、定性离子 m/z、碰撞能和保留时间窗口，标明对应内标
- 校准样本浓度表
- 每个标准曲线点的名义浓度，单位统一；最好覆盖样本预期浓度的上下范围
- 样本信息表
- 样本名、类型（样本、空白、校准、QC）、进样顺序、批次、稀释倍数和取样量
分析步骤
- 1
确认离子对与色谱峰
逐个代谢物检查定量离子和定性离子是否在同一保留时间出峰、峰形对称。定性离子与定量离子的峰面积比应与标准品接近，偏差过大提示有共流出干扰，需要换离子对或调整积分窗口。
- 2
峰积分与人工复核
用 Skyline、MultiQuant、MassHunter 等软件自动积分，再抽查低浓度样本和异常值样本的积分边界。基线抬高、峰拖尾或肩峰被截断都会直接改变浓度，复核时以内标峰为参照判断保留时间漂移。
- 3
计算响应比
用目标物峰面积除以对应内标峰面积得到响应比。优先使用同位素标记的同一化合物作为内标；没有时选结构和保留时间相近的类似物，并在报告中注明哪些代谢物用了替代内标。
- 4
拟合标准曲线
以名义浓度为横坐标、响应比为纵坐标做回归，常用线性加 1/x 或 1/x² 加权。看反算浓度的偏差而不是只看 R²：各校准点反算值与名义值的偏差应在预设范围内，超出的点需说明剔除理由。
- 5
定量与范围判定
用曲线把样本响应比换算成浓度，再乘以稀释倍数、除以取样量得到最终单位。低于定量下限的标注为 <LOQ，高于曲线最高点的应稀释后重测，而不是外推。
- 6
质控与批间评估
检查低、中、高浓度 QC 样本的准确度和精密度，以及混合 QC 在整个序列中的 RSD。空白样本出现目标物或内标信号说明有残留或污染；QC 随进样顺序单调漂移时需要做漂移校正。
- 7
统计分析与可视化
浓度矩阵通常先做 log 转换再做组间检验和多重检验校正，<LOQ 值按预先规定的方式处理。结果用箱线图、热图和通路图展示，并同时提供原始浓度表方便复核。
关键参数与决策
定量离子与定性离子
定量离子选信号最强且无干扰的碎片，定性离子用于确认身份。两者的离子比在样本中偏离标准品较多时，说明峰里混有其他物质，此时浓度不可靠。
回归模型与加权
浓度跨越多个数量级时，不加权的线性回归会被高浓度点主导，低浓度端误差很大。1/x 或 1/x² 加权能平衡各点的相对误差；出现明显弯曲时可考虑二次回归，但需说明理由。
LOD 与 LOQ
常用信噪比约 3 定为检测限、约 10 定为定量下限，也可用最低校准点在准确度和精密度满足要求时作为 LLOQ。低于 LOQ 的值不应当作精确数值参与比较。
QC 接受标准
生物分析方法验证指南中常见的经验标准是 QC 准确度在名义值 ±15% 以内，LLOQ 处放宽到 ±20%。代谢组面板通常按此或略宽的标准执行，应在分析前写明。
<LOQ 值处理
常见做法有填 LOQ/2、填 LOQ/√2 或在统计中按删失数据处理。大量样本低于 LOQ 的代谢物，组间比较的意义有限，宜改报检出率。
常见错误
- 只用 R² 评价标准曲线：R² 大于 0.99 时低浓度点仍可能偏差 30% 以上，应看各点反算浓度的相对偏差。
- 内标与目标物保留时间差很远：两者受到的离子抑制不同，内标无法校正基质效应，浓度会系统性偏高或偏低。
- 用纯溶剂标准曲线定量血浆或组织样本：忽视基质效应，应使用基质匹配曲线或同位素内标，并做加标回收评估。
- 样本浓度超过最高校准点仍直接外推：检测器饱和或非线性会使结果低估，正确做法是稀释后重新进样。
- 同分异构体未分离却分别报告浓度：如亮氨酸与异亮氨酸，若色谱未分开，结果实际是两者之和。
- 不打乱进样顺序：先跑完对照再跑病例，仪器响应漂移会与分组混杂，被误判为真实的组间差异。
结果怎么看
标准曲线图
每个代谢物一张，横轴浓度、纵轴响应比，标出回归方程、权重和各点反算偏差。点沿直线分布、残差无系统趋势为好；低端点残差都偏向同一侧，说明加权方式不合适或存在空白干扰。
浓度结果表
行为样本、列为代谢物，单位明确，并标注 <LOQ、>ULOQ 和缺失。复核时看同一组内是否有个别样本数值高出一个数量级，常见原因是稀释倍数录错或积分错误。
QC 汇总表
列出各 QC 水平的平均浓度、准确度和 CV，以及混合 QC 的 RSD。某个代谢物 QC 反复不达标时，应在结果中标记或剔除，而不是只报告其他代谢物。
QC 随进样顺序图
横轴为进样顺序，纵轴为 QC 或内标响应。理想情况是围绕均值小幅波动；出现阶梯跳变多为批次切换，持续下降提示离子源污染，需要漂移校正或重新进样。
和相近方法怎么选
靶向与非靶向代谢组
非靶向用高分辨质谱尽量多地检测特征，适合发现差异代谢物，但定量是相对的、鉴定可信度不一。靶向只测预设代谢物，可给出绝对浓度。常见路线是先非靶向筛选，再用靶向在独立样本中验证。
MRM 与 PRM
MRM 在三重四极杆上监测预设的离子对，灵敏度高、通量大。PRM 在高分辨仪器上采集前体离子的全部碎片，选择性更好，事后可换碎片定量，但同一时间能监测的目标数通常较少。
绝对定量与相对定量
有标准品曲线和合适内标时可做绝对定量，结果可跨研究比较。只有内标或只看峰面积时属于相对定量，只适合同一批次内的组间比较，报告时不应写成浓度单位。
常见问题
标准曲线 R² 达到多少才合格？
R² 只是参考，很多实验室要求大于 0.99，但更重要的是各校准点反算浓度的偏差，常用经验标准是在 ±15% 以内、最低点 ±20% 以内。R² 很高但低浓度点偏差大，仍说明曲线在低端不可靠。
没有同位素内标怎么办？
可以选结构相似、保留时间接近、样本中不存在的化合物作为替代内标，并用基质加标回收实验评估校正效果。也可以用标准加入法。报告中应注明哪些代谢物使用了替代内标。
基质效应怎么评估？
常用做法是比较同浓度标准品加入空白基质提取液后与加入纯溶剂中的峰面积之比。比值明显小于 1 是离子抑制，大于 1 是离子增强。偏离较大时应改用基质匹配曲线或同位素内标。
低于检测限的值怎么填？
没有统一标准，常见做法是填 LOQ/2 或 LOQ/√2，或者在统计中当作删失值处理。关键是事先写明方法，并检查结论是否因填补方式不同而改变。低于 LOQ 比例很高的代谢物建议改报检出率。
MRM 离子对怎么选？
通常先用标准品做产物离子扫描，选响应最强、特异的碎片作定量离子，另选一个作定性离子，再优化碰撞能。避免选水丢失等非特异碎片，并检查样本中同一保留时间是否有其他物质共享该离子对。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 中描述样本类型、待测代谢物和已有文件，它会先确认定量方案：内标、曲线模型与加权、LOQ 和 QC 判定标准。随后读取峰面积表，计算响应比、拟合标准曲线并反算校准点偏差，换算浓度并标注超范围值，汇总 QC 精密度，再做组间统计。交付标准曲线图、浓度表、QC 汇总和可复现脚本。
我有 120 个血浆样本的 MRM 峰面积表，含 30 个色氨酸通路代谢物和同位素内标，帮我拟合 1/x² 加权标准曲线，算浓度并比较病例与对照。