疫苗表位预测与人群 HLA 覆盖
疫苗表位设计是在已知抗原的氨基酸序列上，预测哪些片段可能被免疫系统识别：T 细胞表位依赖肽段与 MHC 分子结合并被呈递，B 细胞表位依赖抗体识别蛋白表面的连续区域或构象区域。常规流程是取目标抗原序列，预测 MHC-I 与 MHC-II 结合肽以及线性和构象 B 细胞表位，再用同源序列比对评估候选表位在不同序列中的保守程度，最后按等位基因频率计算一组表位在目标人群中的 HLA 覆盖率。输入最少只需要蛋白序列，必要时加上结构和一批同源序列。所有结果都只是候选的优先级排序，免疫原性必须由实验验证，不能作为临床决策依据。
什么时候用
- 在候选抗原上筛出一批优先级高的 T 细胞表位，供后续实验验证
- 评估一组候选表位在特定地区人群中的 HLA 覆盖率
- 比较多个候选抗原蛋白的表位密度与保守程度
- 为 ELISpot、MHC 多聚体或多肽池实验挑选待测肽段
- 检查已报道表位在新测序的同源序列中是否仍然保守
- 设计抗体检测用抗原片段时，选择表面可及的 B 细胞表位区域
不适合的情况
- 替代免疫学实验：预测只给候选排序，不能证明有免疫原性
- 直接给出临床可用方案：有效性需临床前与临床研究评估
- 构象表位精细定位：没有结构时线性预测难以反映空间折叠
需要准备的数据
- 抗原蛋白序列
- FASTA 格式，需确认是全长成熟蛋白还是片段，并记录来源数据库和登录号。
- 同源序列集
- 同一抗原在不同来源中的序列，用于保守性分析；需先去重并做多序列比对。
- HLA 等位基因清单
- 可用公开的参考等位基因集合，也可按目标人群高频等位基因自定，需写清用了哪些。
- 人群等位基因频率
- 来自 Allele Frequency Net Database 等来源，需注明人群定义和样本来源。
- 抗原结构
- 实验结构或预测结构（如 AlphaFold），用于构象 B 细胞表位预测和表面可及性评估。
分析步骤
- 1
确认抗原与人群
先定清楚用哪一条序列、覆盖哪类人群。胞外区和分泌蛋白更适合做 B 细胞表位；目标人群决定后面选哪些等位基因和哪套频率数据。序列版本选错，后续所有位置编号都会错位，结果无法与文献对照。
- 2
MHC-I 结合肽预测
对 8–11 聚体（以 9 聚体为主）逐一打分，常用 NetMHCpan、MHCflurry 等模型，按 %rank 排序。常见经验阈值是 %rank 不超过 0.5 为强结合、不超过 2 为弱结合。同一肽在多个等位基因上都落入强结合区间，更值得保留。
- 3
MHC-II 结合肽预测
对 13–25 聚体（常跑 15 聚体）用 NetMHCIIpan 等模型预测，常用 %rank 不超过 2 和不超过 10 作为强、弱结合阈值。II 类结合槽两端开放、基序更宽松，预测准确度普遍低于 I 类，候选列表应留得更长再靠实验筛。
- 4
B 细胞表位预测
线性表位常用 BepiPred 等序列模型；有结构时用 DiscoTope、ElliPro 等基于结构的方法，并结合表面可及性和柔性一起看。这类预测准确度有限，结果更适合用来缩小实验扫描范围，而不是直接定表位边界。
- 5
保守性分析
把候选表位放回同源序列的多序列比对中，统计它在多少比例的序列里完整保留，或在设定一致性下保留。只在少数序列中出现的表位，换一批样本序列就可能失效；同时记录常见替换落在肽段的哪个位置。
- 6
自身相似性与可行性过滤
把候选肽与人类蛋白组比对，去掉与自身蛋白高度相似的片段，降低交叉反应风险；再筛查过敏原性、毒性和溶解度等合成与成药性指标。这一步常会筛掉相当比例的高分肽，应记录每一条被排除的原因。
- 7
人群覆盖率计算
用 IEDB 的 population coverage 工具，输入表位与等位基因的配对关系和目标人群，得到覆盖率、人均命中数和 PC90。按贪心方式增删少数表位，往往能在肽段数量不变的情况下明显提高覆盖率。
- 8
候选列表与验证方案
输出带结合排名、保守性、等位基因覆盖和过滤标记的候选表，并给出实验安排：T 细胞表位用多肽池 ELISpot 初筛、MHC 多聚体染色确认限制性等位基因，B 细胞表位用 ELISA 或肽扫描验证。
关键参数与决策
%rank 阈值
%rank 把分数与一批随机肽的背景分布比较，跨等位基因可比，一般优于绝对亲和力阈值。I 类常用 0.5% 与 2%，II 类常用 2% 与 10%（经验值）。放宽会抬高实验成本，收紧则容易漏掉覆盖稀有等位基因的肽。
等位基因集合
等位基因选得越多，覆盖率数字越好看，但很多等位基因在目标人群里频率极低。常见做法是用公开参考集合，或取累计频率达到一定比例的高频等位基因，并在结果中写清口径。
肽长范围
I 类以 9 聚体为主，8 到 11 都应跑一遍；II 类常跑 15 聚体并关注 9 聚体核心。只跑单一长度会漏掉真实表位，范围放太宽则产生大量高度重叠的冗余候选，需要按重叠度去冗余。
保守性阈值
保守性通常定义为「在多少比例的同源序列中以不低于某一一致性出现」。要求完全一致最严格，适合高度保守区；稍放宽可纳入只差一个残基的变体，但要单独确认该替换是否落在结合关键位点上。
预测模型选择
I 类模型中 NetMHCpan 同时利用结合亲和力与质谱洗脱配体数据，等位基因覆盖广；MHCflurry 便于本地批量运行。不同模型的排名差异不小，常用两套取交集提高可信度，并记录模型版本。
覆盖率优化目标
除总覆盖率外，还要看人均命中数和 PC90（90% 人群至少被命中的表位数）。总覆盖率高但人均命中只有一两条时，个体层面冗余不足，单条预测出错就可能让一部分人群没有表位命中。
常见错误
- 只按结合分数排序：结合强不等于能被天然加工呈递，还要看蛋白酶切和转运环节，否则候选里会混进实验无反应的肽。
- 用绝对 IC50 阈值跨等位基因比较：不同等位基因的分数尺度不同，排名会被少数等位基因主导，应改用 %rank。
- 等位基因清单塞满高分等位基因：人群中频率极低的等位基因会把覆盖率算得虚高，换成真实频率后明显下降。
- 跳过保守性分析：候选表位可能落在高变区，换一批同源序列复核时就不再存在，结论站不住。
- 不与人类蛋白组比对：与自身蛋白高度相似的肽有交叉反应风险，留到实验阶段才发现会浪费合成成本。
- 把线性 B 细胞表位预测当定论：真实表位多为构象性，按预测边界截取片段常常测不到抗体结合。
结果怎么看
候选表位表
每行一个肽段，含序列、起止位置、等位基因、%rank、保守性比例和过滤标记。如果所有高分肽都挤在蛋白的一小段区域，通常说明该段富含疏水残基，需确认它是不是跨膜区或信号肽。
表位位置分布图
沿抗原序列标出 MHC-I、MHC-II 与 B 细胞表位的位置和密度。T 细胞表位常落在结构相对内部的区段，B 细胞表位集中在表面环区；两类表位完全重叠时，应结合结构重新核对预测结果。
人群覆盖率表与曲线
给出各人群的覆盖率、人均命中数和 PC90，并随表位数增加绘制覆盖率曲线。曲线很快进入平台，说明继续加表位收益有限；人群之间差距很大时，要为低覆盖人群补充其高频等位基因对应的表位。
保守性统计表
列出每个候选表位在同源序列集中的保留比例和常见替换位置。保留比例高但替换恰好落在结合关键残基上时，要把该变体肽单独做一次结合预测，再决定是否保留这条候选。
结构上的表位标注
把候选表位映射到结构上着色，查看是否暴露在表面。B 细胞候选落在包埋区域，说明序列预测与结构不一致，应剔除或改用基于结构的方法重算；T 细胞候选不受此限制。
和相近方法怎么选
T 细胞表位预测与 B 细胞表位预测
T 细胞表位是被 MHC 呈递的短肽，有大量结合实验和质谱洗脱配体数据支撑，模型相对可靠；B 细胞表位由抗体识别蛋白表面，常为构象性，可用训练数据少，预测准确度明显更低。以抗体应答为终点时，结构信息比序列模型更值得依赖。
MHC-I 与 MHC-II 预测
I 类结合槽两端封闭，肽长集中在 9 聚体，基序清晰，预测较准；II 类槽两端开放、肽长可变、结合核心位置不确定，预测误差更大。两者对应的应答类型不同，多表位研究通常都纳入，但 II 类候选需要更多实验筛选。
表位疫苗设计与新抗原预测
两者共用 MHC 结合预测和 HLA 信息，出发点不同：新抗原预测从肿瘤体细胞突变出发，针对单个患者的突变肽和其自身 HLA 分型；表位疫苗设计从已知抗原序列出发，面向人群，需要额外做跨序列保守性和人群 HLA 覆盖率计算。
单一表位与多表位组合
单个表位只能覆盖少数等位基因，个体之间差异很大；多表位组合通过覆盖不同 HLA 超型提高人群覆盖率，但肽段增多会抬高合成与验证成本。常见做法是用覆盖率曲线，在收益开始递减处确定表位数量。
常见问题
%rank 和 IC50 哪个更适合筛表位？
一般用 %rank。IC50 预测值的尺度在不同等位基因之间不可直接比较，结合槽偏好明显的等位基因会系统性占优；%rank 把分数与随机肽背景比较，跨等位基因可比。实际做法是先按 %rank 筛选，再把 IC50 或洗脱配体分数作为辅助排序依据。
人群 HLA 覆盖率是怎么算出来的？
工具根据目标人群中各 HLA 等位基因的频率，结合每个表位能被哪些等位基因结合，推算至少有一个表位命中的个体比例。所以覆盖率完全依赖频率数据代表的人群：用全球平均频率算出的数字，不能直接套用到某个特定地区人群上。
表位预测结果需要做哪些实验验证？
T 细胞表位常用多肽池刺激后的 ELISpot 或细胞内因子染色筛出有反应的肽，再用 MHC 多聚体染色确认限制性等位基因；B 细胞表位常用 ELISA、肽扫描或与已知抗体的竞争结合实验。预测的作用是把待测肽数量压到实验可承受的范围。
保守性要在多少条序列里评估？
取决于抗原本身的变异程度。常见做法是从公共数据库取同一抗原在不同来源、不同时间和不同地区的序列，去重后比对，并在方法中写明序列条数和时间跨度。序列集偏向某个地区或某个年份时，算出的保守性会偏乐观。
有了 MHC 结合预测，还要做呈递相关的其他预测吗？
有一定帮助。结合只是呈递链条中的一环，肽还要经过蛋白酶体切割和转运。部分工具会把切割、转运和结合整合成综合分数，可用于在结合分数接近的候选之间排序，但这些环节的预测准确度低于结合预测本身，不宜作为唯一依据。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 中提供抗原序列、目标人群，以及可选的同源序列集和结构后，会先确认等位基因清单、肽长范围和 %rank 阈值，再进行疫苗表位与人群 HLA 覆盖设计：完成 MHC-I、MHC-II 结合肽预测与 B 细胞表位预测，统计候选表位的跨序列保守性，并计算人群覆盖率、人均命中数和 PC90。交付候选表位表、表位位置分布图、覆盖率表与曲线、分析报告和可复现脚本。
我有一个病原体表面蛋白序列和 200 条同源序列，想筛 MHC-I 和 MHC-II 表位，看保守性，并算中国人群的 HLA 覆盖率。