BCR 抗体谱系与体细胞超突变分析
B 细胞在骨髓中通过 V(D)J 重排产生独特的受体序列，受抗原刺激后在生发中心经历体细胞超突变（SHM）和类别转换。来自同一个祖先 B 细胞的后代共享相同的重排结构，只在突变上有所不同，这样的一组细胞称为一个克隆。BCR 抗体谱系分析就是从测序数据中识别这些克隆，追溯各成员相对于胚系序列积累了哪些突变，并重建它们的进化关系。典型数据包括 bulk BCR 扩增子测序（常带 UMI）和 10x Genomics 等单细胞 V(D)J 测序，后者能提供同一细胞的重链与轻链配对。分析结果可用于研究疫苗或感染后的 B 细胞应答、自身免疫中的克隆扩增，以及 B 细胞淋巴瘤的克隆演化。
什么时候用
- 研究免疫接种或感染前后 B 细胞克隆扩增与亲和力成熟过程
- 比较自身免疫病患者与对照的克隆多样性和突变负荷
- 单细胞数据中把 BCR 克隆信息与细胞亚群、转录状态关联
- 追踪同一克隆在不同组织或时间点之间的分布与类别转换
- 重建克隆内谱系树，观察突变积累顺序
不适合的情况
- 只关心整体多样性和 V 基因使用频率时，常规免疫组库分析即可
- RNA-seq 中抽提的少量 BCR 读段，难以支撑可靠的谱系树
- 只有 CDR3 氨基酸序列而无完整 V 区序列时，无法定量体细胞超突变
需要准备的数据
- BCR 序列数据
- bulk 扩增子测序 FASTQ（带 UMI 更好），或单细胞 V(D)J 组装结果，如 contig 注释表和 FASTA
- 胚系参考库
- IMGT 等来源的 V、D、J 基因参考序列，物种和版本需与注释工具一致
- 样本信息
- 个体编号、组织、时间点、细胞分选类型；克隆定义必须在同一个体内进行
- 单细胞表达数据（可选）
- 同一批细胞的基因表达矩阵与细胞类型注释，条形码需能与 V(D)J 数据对应
分析步骤
- 1
预处理与组装
bulk 数据用 pRESTO 等工具按 UMI 构建一致序列，校正 PCR 和测序错误；单细胞数据使用厂商流程组装 contig。检查每个 UMI 或细胞的支持读数，过低的序列应过滤。
- 2
V(D)J 注释
用 IgBLAST 比对胚系参考，确定 V、D、J 基因、CDR3 和连接区，并转换为 AIRR 标准格式。过滤非功能性重排和含终止密码子的序列。
- 3
推断个体基因型
用 TIgGER 推断每个个体实际携带的 V 等位基因并发现新等位基因。未纳入的胚系多态会被当作突变，导致超突变率被高估。
- 4
确定克隆阈值
用 SHazaM 计算每条序列与最近邻序列的连接区距离，分布通常呈双峰，取两峰之间的低谷作为阈值。若分布不呈双峰，需要谨慎设定并做敏感性分析。
- 5
定义克隆
在同一个体内，把 V 基因、J 基因和连接区长度相同、连接区距离低于阈值的序列归为一个克隆，可用 Change-O 的 DefineClones 等工具完成。单细胞数据可结合轻链进一步拆分。
- 6
重建胚系与定量突变
为每个克隆重建胚系序列，以此计算 V 区突变频率，区分 CDR 与 FWR、替换与沉默突变。比较不同同种型、细胞亚群或时间点的突变水平。
- 7
构建谱系树
对成员数足够的克隆用 dowser、IgPhyML 等工具构建系统发育树，以胚系序列为根，节点标注同种型、组织或时间点，观察突变积累路径。
关键参数与决策
克隆距离阈值
阈值决定克隆的粒度。过严会把同一克隆拆成多个，过松会把独立重排合并。优先根据最近邻距离分布确定，并报告所用阈值和距离度量。
距离度量
连接区距离可以按核苷酸汉明距离计算，也可用考虑突变热点偏好的模型。不同度量对应的阈值不同，不能直接套用他人发表的数值。
序列过滤标准
常见过滤包括去除非功能性序列、低 UMI 支持序列和单细胞中有多条重链的条形码。过滤过松会引入嵌合和双细胞，过严会丢失低丰度克隆。
突变计数区域
超突变率通常只在 V 区计算，并排除受引物覆盖的区域，因为引物序列来自设计而非真实模板，会掩盖真实突变。
谱系树最小克隆大小
只有少数成员的克隆建树信息量很低。通常只对成员数达到一定数量的克隆建树，具体门槛依据研究问题和数据量设定并说明。
常见错误
- 跨个体合并后定义克隆：不同个体之间可能出现相同或相近的 CDR3（公共克隆型），混在一起会把独立事件误判为同一克隆。
- 不推断个体基因型直接计算突变：个体携带的新等位基因被当成体细胞突变，使突变率被系统性高估。
- 照搬固定克隆阈值：不同数据集的测序错误率和突变水平不同，固定阈值可能显著拆分或合并克隆，应按距离分布确定。
- 单细胞数据保留多重链的条形码：双细胞或环境 RNA 会造成错误的重链轻链配对，影响克隆定义和抗体序列重建。
- 用 PCR 扩增后的读段数量代表克隆大小：没有 UMI 时扩增偏好会扭曲克隆频率，应以 UMI 或细胞数计数。
结果怎么看
最近邻距离分布图
横轴为每条序列到最近邻的连接区距离。理想情况呈双峰，左峰为同克隆成员，右峰为无关序列，阈值取在低谷。分布单峰或低谷不明显时，克隆定义的不确定性较大。
克隆大小与多样性图
展示克隆大小分布、前若干大克隆占比和多样性指数。抗原应答中常见少数克隆显著扩增；不同样本测序深度差异大时，应先下采样再比较多样性。
体细胞超突变箱线图
按同种型、细胞亚群或时间点比较 V 区突变频率。类别转换后的 IgG、IgA 通常高于 IgM、IgD；若初始 B 细胞也显示高突变，应检查胚系参考与基因型推断。
克隆谱系树
以胚系序列为根，枝长代表突变数，节点颜色标注同种型或时间点。可以看出哪些分支在后期扩增或发生类别转换；枝长普遍很短、拓扑不稳定的树不宜过度解读。
和相近方法怎么选
BCR 谱系分析与免疫组库多样性分析
免疫组库分析关注整体多样性、V 基因使用和克隆型频率，TCR 和 BCR 均适用；BCR 谱系分析在此基础上进一步利用超突变信息定义克隆、量化突变并建树，主要针对 B 细胞。
bulk BCR 测序与单细胞 BCR 测序
bulk 测序序列数多、覆盖低频克隆更好，但无法得到重链轻链配对；单细胞测序能配对并关联转录组状态，细胞数相对较少。研究抗体序列本身时单细胞更有优势。
基于距离的克隆定义与基于似然的方法
基于距离阈值的方法简单、可解释，适合多数数据；基于模型或谱聚类的方法在克隆边界不清时更灵活，但参数更多。可用两种方法交叉验证主要结论。
常见问题
BCR 克隆型是怎么定义的？
常见做法是在同一个体内，将 V 基因、J 基因相同、连接区长度相同且连接区序列相似度高于阈值的序列归为同一克隆。阈值一般根据最近邻距离分布确定。单细胞数据可以再用轻链信息校验，减少误合并。
体细胞超突变率怎么计算？
先为每条序列或每个克隆确定胚系序列，再统计 V 区内与胚系不同的位置数，除以比对长度得到突变频率。通常排除引物区域，并可区分 CDR 和 FWR、替换和沉默突变，用于分析选择压力。
10x 单细胞 V(D)J 数据怎么接入谱系分析？
可以使用流程输出的 contig 注释和 FASTA，用 IgBLAST 重新注释并转为 AIRR 格式，再进入基因型推断、克隆定义和建树流程。同时按条形码与基因表达数据合并，就能比较不同克隆的细胞状态。
为什么需要推断个体基因型？
公共参考库不包含每个人的全部 V 等位基因。若个体携带参考库中没有的等位基因，比对时这些差异会被当作突变，导致突变率和谱系树都出现偏差。推断基因型可以减少这一误差。
Immcantation 包含哪些工具？
Immcantation 是一组配合使用的工具，包括 pRESTO 预处理、Change-O 注释与克隆定义、SHazaM 突变分析与阈值确定、TIgGER 基因型推断、alakazam 多样性分析、dowser 和 IgPhyML 谱系树构建，各工具都支持 AIRR 格式。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 中提供 bulk 或单细胞 BCR 测序数据和样本信息后，会先确认胚系参考、克隆定义方式和阈值确定方法，然后完成 V(D)J 注释、克隆划分、胚系重建、体细胞超突变定量和克隆谱系树构建。交付克隆汇总表、距离分布图、突变比较图、谱系树图和可复现的分析脚本。
我有 6 位受试者接种前和接种后第 7、28 天的 10x 单细胞 V(D)J 数据，想定义 B 细胞克隆、比较超突变水平，并画扩增克隆的谱系树。