HDR 供体模板设计（基因敲入）
同源定向修复（HDR）利用细胞自身的修复机制，在双链断裂处以外源供体模板为模板复制序列，从而把指定改动写进基因组。它是把荧光标签、表位标签、报告基因或任意点突变精确放进内源位点的主要手段。供体有两类常见形式：含长同源臂的双链供体，一般做成质粒或 PCR 产物，用于插入标签和表达框等较长片段；单链寡核苷酸供体，同源臂短，用于引入点突变或很小的插入缺失。典型输入是目标位点序列、已选定的 sgRNA 和切点位置、期望的最终等位基因序列。设计的难点不在实验操作，而在同源臂的位置、防止重复切割的沉默改动，以及能真正区分正确敲入与随机整合的验证方案。
什么时候用
- 在内源位点插入荧光蛋白或表位标签，构建融合表达的细胞系
- 引入碱基编辑器做不到的改变，例如颠换、小片段插入或缺失
- 把报告基因放到内源启动子下游，构建报告细胞系
- 构建条件性等位基因，插入位点特异重组酶识别序列
- 在内源位点精确替换一段序列，例如结构域互换
- 建立携带特定临床变异的细胞模型，用于功能研究
不适合的情况
- 只改一个碱基且方向属于两类碱基转换：碱基编辑不需要供体，效率通常更稳定
- 只需功能缺失：直接靠切割后的插入缺失更省事，不必设计供体
- 细胞几乎不进行同源重组，又无法筛选：效率过低时应改用其他策略
需要准备的数据
- 目标位点基因组序列
- 切点上下游各一到两 kb 的序列，注明基因组版本、链方向和外显子边界，长片段敲入时范围更宽
- 所用细胞的实际序列
- 同源臂区域在该细胞系中的真实序列，与参考基因组不同的多态位点必须按细胞的版本写
- sgRNA 与切点信息
- 原间隔序列、PAM 和预期切点坐标；供体的同源臂以切点为中心而不是以编辑点为中心
- 期望等位基因序列
- 最终想要的完整序列，含标签、接头、读框和终止密码子，以及拟加入的沉默改动
- 验证数据
- 跨接头 PCR 凝胶图、接头测序结果、拷贝数或随机整合检测数据，用于判断敲入是否正确
分析步骤
- 1
写出目标等位基因
先把敲入后希望得到的那条染色体序列完整写出来，包含插入片段、两侧接头、读框和终止密码子，再翻译一遍确认融合蛋白序列正确、没有意外终止密码子。标签在 N 端要处理原起始密码子，在 C 端要去掉原终止密码子并补上新的。这条序列是后面所有设计和比对的参照。
- 2
确定同源臂的中心
同源臂要以 sgRNA 的切点为中心向两侧延伸，而不是以编辑点为中心。编辑点离切点越远，被成功写入的概率越低，所以选 sgRNA 时就要让切点尽量靠近改动位置。插入片段把同源臂天然分成左右两段，左臂终止于切点一侧、右臂起始于另一侧，中间是要插入的序列。
- 3
选择供体形式
改动只有几个碱基到十几个碱基，用单链寡核苷酸供体，同源臂短、合成即得、不涉及载体构建；要插入标签或表达框等较长片段，用含长同源臂的双链供体，做成质粒或 PCR 产物。两种形式的同源臂长度量级差别很大，不要把单链供体的设计思路直接套到长片段敲入上。
- 4
加入防重切改动
敲入成功的等位基因如果仍然能被 sgRNA 识别，会被反复切割并最终产生插入缺失。做法是在供体上破坏 PAM 或原间隔序列靠近 PAM 的几个碱基：编码区用同义突变，非编码区选择不影响已知调控元件的位置。改完要确认没有引入新的剪接位点，也没有把密码子换成该细胞中极少用的形式。
- 5
设计验证引物
跨接头引物对必须一条落在同源臂之外的基因组序列上、另一条落在插入片段内部。两条都落在同源臂内会把残留供体一起扩出来，产生看着完美的假阳性。左右接头各设计一对，再准备一对扩整个位点的引物用于区分野生型、杂合和纯合，以及一对针对供体骨架的引物检测骨架整合。
- 6
分级验证克隆
先用跨接头 PCR 初筛，两侧接头都有正确条带的克隆才进入下一步；再对两个接头测序，确认接头序列、读框和防重切改动都按设计写入；最后评估拷贝数和随机整合，排除串联插入和在非目标位点的额外整合。表达层面再确认一次融合蛋白的分子量和定位。
关键参数与决策
同源臂长度
单链寡核苷酸供体的同源臂短，总长受合成长度限制，两侧大致均衡分配；长片段敲入的双链供体同源臂长得多，常见做法是左右各几百 bp 到约一 kb，片段越长需要越长的臂。臂过短效率低，过长增加构建难度，先用常规长度试，不足再加长。
编辑点与切点的距离
这是影响成功率最直接的参数。改动越靠近切点越容易被写入，距离拉远后即使发生了同源重组，远端的改动也可能没被复制过去。选 sgRNA 时就应优先让切点落在改动附近，必要时为了缩短这个距离而接受稍差的 sgRNA 评分。
防重切改动的位置
优先破坏 PAM，一个碱基的同义改动往往就够；PAM 落在无法同义改动的位置时，改原间隔序列靠 PAM 一侧的几个碱基。改动数量够用即止，改得过多会影响同源臂与基因组的匹配。改完必须回头确认该位置不再被 sgRNA 识别。
单链供体的链选择
单链寡核苷酸供体可以按两条链中任一条合成，公开报道中哪条更优的结论并不一致，且与位点有关。实际建议是两条链各做一份平行试验，用实测效率决定，不要只凭一条规则选定。
筛选策略
HDR 效率远低于切割效率，纯靠极限稀释筛克隆工作量大。常用做法是在插入片段中带可筛选标记，再用位点特异重组酶切掉；或插入片段带荧光蛋白，按荧光分选。注意标记和残留的重组酶识别序列会留在基因组里，设计时就要定好能否接受。
常见错误
- 同源臂按编辑点居中设计而不是按切点居中：同源重组从断裂处起始，远离切点的改动常常没被复制进去，测序显示位点被编辑过但目标改动缺失。
- 供体上没有破坏 PAM 或原间隔序列：敲入成功的等位基因被反复切割，最终得到的是带插入缺失的产物，而不是设计的序列。
- 两条验证引物都落在同源臂内部：残留的供体模板会被扩出来给出正确长度条带，初筛看起来效率很高，挑出的克隆实际没有发生敲入。
- 按参考基因组而不是按细胞实际序列设计同源臂：细胞系自身的多态位点会降低重组效率，还可能把参考序列的碱基当成改动写进基因组。
- 只验证一侧接头：另一侧可能是不完整整合或片段串联，得到的细胞系在基因组层面结构异常，表达和表型都不可解释。
结果怎么看
跨接头 PCR 凝胶图
左右接头各一对引物，正确敲入的克隆两侧都给出符合预测长度的单一条带，野生型无条带或长度明显不同。只有一侧有条带提示不完整整合。若所有克隆包括阴性对照都有条带，几乎一定是引物落进了同源臂、扩到了残留供体。
位点整体扩增结果
用同源臂之外的一对引物扩整个位点，可以同时看到野生型和敲入型等位基因。杂合克隆给出两条带，纯合克隆只给敲入型长条带。只出现野生型长度的克隆是未编辑的，只出现一条异常长度条带时要测序确认不是大片段缺失。
接头测序比对
把两个接头的测序结果与目标等位基因逐碱基比对，确认接头处无多余或缺失碱基、读框连续、防重切的沉默改动确实存在。接头处出现小插入缺失说明是末端连接而非同源重组介导的整合，这类克隆不能用。
拷贝数与随机整合检测
评估插入片段在基因组中的拷贝数，并用针对供体骨架的引物检查骨架是否整合。拷贝数明显高于预期提示串联插入或额外整合；骨架引物出阳性说明质粒整体整合进基因组。这两类克隆即使接头正确也应排除。
和相近方法怎么选
HDR 敲入与碱基编辑
碱基编辑不需要供体、不产生双链断裂，在原代和难重组细胞里效率更稳定，但只能做两类碱基转换，且受编辑窗口和旁位编辑限制。HDR 能做任意替换、插入标签和较长片段，覆盖面大得多，代价是效率低、需要筛选、还要排除随机整合。改动属于碱基编辑覆盖范围时优先碱基编辑，其余情况走 HDR。
单链寡核苷酸供体与长同源臂双链供体
单链供体同源臂短、直接合成、不需构建载体，适合点突变和很小的插入缺失，但承载长度有限。双链供体可以携带标签、报告基因和筛选标记，但要构建质粒或制备 PCR 产物，且质粒形式存在骨架整合风险。按要插入的长度选形式，长度在两者之间时优先试双链供体加筛选。
内源位点敲入与随机整合的过表达质粒
敲入把序列放在内源位点，受自身启动子和调控元件控制，表达水平接近生理状态，适合研究内源功能和定位。过表达质粒构建快、表达高，但拷贝数和插入位置不可控、表达远超生理水平，容易产生人为表型。研究内源调控选敲入，只需大量蛋白或快速验证选过表达。
常见问题
同源臂应该设计多长
按供体形式分。单链寡核苷酸供体的同源臂短，受合成长度限制，两侧大致均衡分配即可，用于点突变和小改动。长片段敲入的双链供体同源臂要长得多，常见做法是左右各几百 bp 到约一 kb，插入片段越长通常需要越长的臂。更关键的是臂要以切点为中心、落在非重复区、并按细胞实际序列书写。
为什么敲入效率很低
按顺序排查：切割效率是否足够，没有断裂就没有同源重组，先单独验证 sgRNA 的插入缺失率；编辑点与切点距离是否过远；同源臂是否按细胞实际序列设计、是否落在重复区；供体形式和剂量是否合适。同源重组本身在不同细胞类型中差别很大，效率低到无法筛选时应考虑引入筛选标记。
怎么防止敲入后的等位基因被再次切割
在供体上破坏 sgRNA 的识别基础。首选改 PAM，编码区用同义突变即可；PAM 不便改动时改原间隔序列靠 PAM 一侧的几个碱基。改完确认该位置不再匹配 sgRNA，并检查没有引入新的剪接位点、没有换成罕用密码子。这一步同时避免供体自身在细胞内被切开。
如何区分真正的位点敲入和随机整合
关键是引物设计：跨接头引物对必须有一条落在同源臂之外的基因组序列上。随机整合的片段不带侧翼基因组序列，这样的引物对扩不出来。再配合插入片段拷贝数评估和针对供体骨架的引物，可以发现串联插入和质粒整体整合。三项都通过的克隆才能认定为正确敲入。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 的生信模式里说明目标位点、要插入或替换的内容和所用细胞，它会先拼出完整的目标等位基因序列并翻译核对读框，再按切点为中心划分左右同源臂、给出供体形式建议、标出用于阻断重复切割的沉默改动位置，并检查同源臂是否落在重复区或含多态，同时输出跨接头引物、位点整体扩增引物和骨架检测引物，交付设计表、序列文件、结果说明和可复现脚本。
我想在 HeLa 细胞里给内源 TP53 的 C 端敲入一个 mNeonGreen，已经选好 sgRNA，帮我设计供体和验证引物