碱基编辑设计与编辑效率分析
碱基编辑把失活或只切单链的 Cas 蛋白与脱氨酶融合在一起，在不产生双链断裂的前提下改写单个碱基。胞嘧啶碱基编辑器（CBE）把 C 变成 T，对应互补链上是 G 变成 A；腺嘌呤碱基编辑器（ABE）把 A 变成 G，对应 T 变成 C。两类编辑器各自只能做一种转换方向，所以第一步永远是确认你想要的改变属于哪一类，否则后面的设计全部作废。典型应用包括引入或修复单核苷酸变异、把密码子改成终止密码子以实现功能缺失、构建点突变细胞系和等位基因系列。典型数据是编辑后基因组 DNA 的目标区扩增产物，用 Sanger 测序或扩增子深度测序读出每个位置的碱基组成比例。
什么时候用
- 需要在基因组中引入或回复一个单碱基替换，且方向属于 C 到 T 或 A 到 G
- 希望避免双链断裂带来的插入缺失和大片段重排
- 把目标密码子改为终止密码子，构建不依赖插入缺失的功能缺失模型
- 在原代细胞或难以同源重组的细胞中做点突变
- 构建同一位点的多个等位基因，比较不同变异的功能差异
- 评估已知致病位点的功能，建立对应的细胞模型
不适合的情况
- 需要做颠换、插入、缺失或替换整段序列：碱基编辑器做不到，应考虑其他策略
- 编辑窗口内有多个同类碱基且都不能变：旁位编辑难以避免
- 目标位点附近找不到合适 PAM，窗口无法对齐目标碱基
需要准备的数据
- 目标位点序列
- 目标碱基上下游各数百 bp 的基因组序列，标明基因组版本、链方向和目标碱基的精确坐标
- 变异与蛋白信息
- 期望的碱基改变、对应的氨基酸改变和转录本编号，用于判断旁位编辑是否会改变蛋白
- 编辑器与宿主信息
- 拟用的编辑器类型与 Cas 骨架对应的 PAM 要求，以及细胞或物种，用于避开常见多态位点
- 编辑后扩增子数据
- 目标区扩增产物的 Sanger 测序 ab1 文件，或双端扩增子测序 FASTQ，含未编辑对照样本
分析步骤
- 1
确定编辑方向
把目标碱基和期望结果写成链明确的形式，例如正链上 C 变 T 选 CBE，正链上 A 变 G 选 ABE。如果正链上的改变不属于这两类，检查互补链：正链 G 变 A 在负链上就是 C 变 T，仍然可做。方向确定不了就不要往下设计。
- 2
枚举候选 sgRNA
在目标碱基两侧按所选 Cas 骨架的 PAM 规则扫描，列出所有能把目标碱基覆盖进编辑窗口的 20 nt 原间隔序列。对 SpCas9 骨架，通常把远离 PAM 的一端记为第 1 位，编辑活性集中在中间偏 PAM 远端的几个位置。把目标碱基落在窗口中心的候选排在前面。
- 3
评估旁位编辑
对每条候选 sgRNA，列出窗口内所有与目标同类的碱基，逐个判断如果它们也被改写会发生什么：同义改变可以接受，错义或影响剪接位点则需要换 sgRNA。窗口内只有目标碱基一个同类碱基的候选是最理想的，实际常需要在编辑效率和旁位风险之间取舍。
- 4
检查脱靶风险
把候选原间隔序列在参考基因组里比对，列出错配数少的相似位点，重点关注落在外显子和已知调控区的位点。同时注意目标区是否存在常见多态，多态会让 sgRNA 在部分样本中不匹配。最终保留两到三条设计用于平行试验。
- 5
设计检测扩增子
设计一对引物，使扩增产物把编辑窗口包含在中间而不是边缘，长度适合所选测序方式。引物要落在同源区外、避开目标位点自身，否则引物序列会掩盖编辑结果。同时设计覆盖主要候选脱靶位点的扩增子。
- 6
测序读出编辑率
扩增后测序，把每个位置的四种碱基计数转成比例。Sanger 图谱可用峰高比例做半定量，扩增子深度测序能给出每条读段的等位基因组合。一定要同时做未处理对照，用对照中同一位置的背景比例作为判读基线。
- 7
统计效率与副产物
报告目标位置的转换比例、窗口内每个旁位的转换比例、插入缺失比例，以及同时含目标编辑和旁位编辑的等位基因占比。单看平均编辑率会掩盖问题：要确认获得的是纯净的目标编辑型等位基因，而不是混杂旁位改变的组合。
关键参数与决策
编辑器类型与版本
按碱基转换方向先选 CBE 或 ABE，再在同类中选择活性与窗口宽度的组合。活性更高的版本编辑效率高但窗口往往更宽、旁位编辑更多；窄窗口版本旁位少但对位置更挑。先用常规版本试，旁位严重再换窄窗口版本。
目标碱基在窗口中的位置
这是最关键的决策点。目标碱基越靠编辑窗口中心，效率通常越高；落在窗口边缘时可能几乎不编辑。实际做法是选两三条把目标碱基分别放在窗口不同位置的 sgRNA 平行试，用实测效率决定，而不是只靠预测分数。
PAM 与 Cas 骨架
窗口位置由 PAM 决定，PAM 受限时目标碱基可能无法对齐。可以换用 PAM 要求更宽松的 Cas 变体来获得更多候选窗口，代价通常是脱靶谱变宽。先用标准骨架找候选，找不到合适窗口再考虑放宽 PAM。
扩增子测序深度
深度决定能分辨多低的编辑比例。细胞群体中编辑率通常不低，常规深度足够；要检出低比例等位基因就需要更高深度，并用未处理对照估计背景错误率，低于背景水平的信号不作为编辑。
判读窗口范围
分析时要显式指定统计哪些位置的碱基转换。窗口设得太窄会漏掉偏移的编辑，设成整条扩增子会把测序错误和多态都算进来。常用做法是以原间隔序列为中心，统计全部 20 个位置并单独标出目标位点。
常见错误
- 搞错链方向，用 CBE 去做正链上的 G 到 A：实际能做，但必须按负链设计 sgRNA，照正链设计会完全没有编辑。设计前先把序列统一到 sgRNA 所在链上。
- 只报告目标位点编辑率，不报旁位编辑：窗口内其他同类碱基常被一起改写，产生的细胞系携带额外错义突变，后续表型无法归因到目标变异。
- 没有做未编辑对照：Sanger 峰高基线和测序错误都会在低比例位置产生假信号，没有对照就无法区分真实的低效率编辑和噪音。
- 引物落在编辑窗口内或紧邻目标碱基：扩增产物末端的序列由引物决定，会把编辑结果覆盖掉，读出的永远是野生型。
- 忽略脱氨酶自身引起的、不依赖 sgRNA 的编辑：这类事件分散在全基因组，靶点扩增子看不到，需要靠更换编辑器版本或全基因组层面的检测来评估。
结果怎么看
原间隔序列位置编辑率柱图
横轴是原间隔序列第 1 到 20 位，纵轴是该位置发生目标类型转换的比例。正常结果是目标位置明显高、窗口外接近对照背景。如果整条序列各位置都有几个百分点的信号，说明背景或比对有问题；如果最高峰不在目标位置，说明窗口没对齐。
等位基因频率表
按读段把窗口序列归类，列出每种等位基因的占比。要看的是只含目标编辑的等位基因有多少，以及同时含旁位编辑的组合有多少。后者占比高时即使总编辑率好看，可用的细胞比例也很低。
插入缺失比例
碱基编辑器通常只产生很低比例的插入缺失。如果插入缺失明显升高，要怀疑质粒中混入了具切割活性的核酸酶、编辑器构建有误，或细胞内存在其他切割来源。
脱靶位点编辑率表
逐个候选脱靶位点列出编辑比例，并与未处理对照比较。对照中同一位点的背景比例是判读基线，超过基线且可重复的位点才算真实脱靶。重点关注落在编码区的位点。
单克隆基因型汇总
每个克隆一行，列出各等位基因序列与氨基酸后果。理想克隆只有目标编辑型等位基因且无旁位改变。出现三种以上等位基因或与群体编辑谱不一致的克隆应当排除。
和相近方法怎么选
碱基编辑与基于同源重组的敲入
碱基编辑不需要供体模板、不产生双链断裂，在难转染和不易同源重组的细胞中更稳定，但只能做两类碱基转换，受编辑窗口和旁位编辑限制。基于同源重组的敲入能做任意替换、插入标签和大片段改造，效率依赖细胞周期和模板递送。只改一个碱基且方向合适时优先碱基编辑，其他走敲入。
CBE 与 ABE
两者互补而不是替代：CBE 做 C 到 T，ABE 做 A 到 G，选哪个完全由目标碱基和链方向决定，没有可比的优劣。实践差别在副产物谱不同，CBE 体系中除目标转换外还可能出现其他碱基产物，ABE 体系的插入缺失通常很低。设计时按方向定类型，按副产物容忍度定版本。
Sanger 半定量与扩增子深度测序
Sanger 便宜快速，看峰高比例能判断有没有编辑、大致多高，适合筛选 sgRNA 和初筛克隆，但分辨率有限、无法给出等位基因组合。扩增子深度测序能定量每个位置并按读段还原等位基因，是报告效率和旁位编辑的依据。常规做法是 Sanger 初筛、深度测序定论。
常见问题
碱基编辑能不能做任意点突变
不能。胞嘧啶编辑器只做 C 到 T，腺嘌呤编辑器只做 A 到 G，连同互补链一起算，可覆盖的是 C 到 T、G 到 A、A 到 G、T 到 C 这四种转换。颠换、插入、缺失都不在碱基编辑器的能力范围内。设计前先把目标改变写成链明确的形式，确认落在上述四种之内，否则需要换别的编辑策略。
编辑窗口里有多个同类碱基怎么办
先逐个判断旁位改写的后果，同义或位于非功能区的可以接受。如果都不能改，可以尝试换 PAM 让窗口平移、让目标碱基留在窗口中心而旁位落到窗口边缘，或改用窗口更窄的编辑器版本。都不行时就在单克隆筛选阶段加大筛选量，专门挑只带目标编辑的克隆。
为什么扩增子测序结果里编辑率很低
常见原因有三类：窗口没对齐，目标碱基落在窗口边缘；递送效率低，真正表达编辑器的细胞比例小；引物或分析窗口设置不当，统计位置错了。排查顺序是先用阳性对照位点确认体系可用，再核对原间隔序列和目标碱基的相对位置，最后检查扩增子是否把窗口包在中间。
如何判断测到的是真实编辑还是测序噪音
必须有未处理样本做对照。把对照中同一位置、同一方向转换的比例作为背景，只有明显超过背景且在重复实验中稳定出现的信号才算编辑。Sanger 图谱同理，要用对照图谱的基线峰高做参照。此外要注意目标区的常见多态也会表现为固定比例的碱基差异。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 的生信模式里描述目标位点、期望的碱基改变和细胞类型，它会先确认编辑方向和编辑器类型，再按 PAM 规则枚举候选 sgRNA，给出每条的编辑窗口位置、窗口内旁位碱基及其氨基酸后果、候选脱靶位点清单，并推荐检测用引物。拿到扩增子测序数据或 Sanger 文件后，它会计算各位置编辑率、等位基因频率表和插入缺失比例，交付图表、统计表、结果说明和可复现脚本。
我要把 PCSK9 第 2 外显子里一个 C 改成 T，在 HEK293T 里做，帮我设计 sgRNA、评估窗口内旁位编辑，并给出检测用引物