CRISPR gRNA 设计与脱靶评估
CRISPR 编辑由向导 RNA（gRNA，常写作 sgRNA）决定作用位置。以常用的 SpCas9 为例，间隔序列约 20 nt 与靶 DNA 互补，靶序列 3 端需紧邻 NGG 形式的 PAM。设计工作要同时满足两点：目标位置的切割效率尽量高，基因组中相似序列处的切割尽量少。不同目的对位置的要求差别很大，敲除看外显子结构，敲入看切点与编辑位点的距离，转录调控看转录起始位点附近的窗口。常用设计工具包括 CRISPOR、CHOPCHOP、CRISPick，脱靶搜索常用 Cas-OFFinder。计算结果只用于排序候选，结论需要测序验证。
什么时候用
- 在细胞系或模型动物中敲除某个基因，研究其功能
- 引入点突变或插入标签，需要切点紧邻编辑位点
- 用 dCas9 做转录抑制或激活，需要选启动子附近靶点
- 用成对 gRNA 删除一段增强子、lncRNA 或基因组区域
- 评估手上已有 gRNA 的潜在脱靶位点并设计验证方案
不适合的情况
- 碱基编辑与先导编辑：它们有各自的编辑窗口和专用设计工具，不能套用敲除规则
- 参考基因组质量差或靶区个体变异未知的物种，在靶与脱靶判断都不可靠
- 把预测评分当成结论，不做任何测序验证
需要准备的数据
- 目标基因或区域
- 基因名、转录本 ID 或基因组坐标；敲除需说明覆盖哪些转录本，敲入需给出精确位点
- 物种与基因组版本
- 用于取序列和全基因组相似性搜索；基因组版本须与下游注释一致
- 核酸酶类型
- SpCas9、SaCas9、Cas12a 的 PAM 与间隔长度不同，决定可用位点范围
- 细胞系变异信息（可选）
- 有测序数据时可检查靶序列和 PAM 是否被该细胞系的变异破坏
分析步骤
- 1
明确编辑目的
先区分敲除、敲入、转录调控三类目的。敲除追求移码造成功能丧失，敲入要求切点离目标碱基尽量近，转录调控要求靶点落在转录起始位点附近。目的不同，后面的筛选标准完全不同。
- 2
确定靶区域
敲除优先选各主要转录本共有、靠近编码区 5 端、含关键功能域的外显子，避开最后一个外显子。外显子长度为 3 的倍数时，整段跳读可能保留部分功能，这类外显子不是理想选择。
- 3
列出候选
在靶区两条链上找出全部符合 PAM 的位点，用设计工具给出在靶效率评分。同一基因一般保留三到四条候选，分布在不同位置，便于后续实验比较而不是只押一条。
- 4
相似位点搜索
在全基因组中搜索与候选序列错配较少的位置，常允许最多三到四个错配，必要时考虑碱基凸起。重点关注落在编码外显子内、且 PAM 近端错配很少的位置，这类风险最高。
- 5
综合排序
按在靶评分、特异性评分和所处位置一起排序。还要检查序列是否含连续 T 等会提前终止转录的信号，用 U6 启动子表达时 5 端第一个碱基常要求为 G，必要时在 5 端补一个 G。
- 6
设计检测引物
围绕切点设计扩增引物，让切点距两端都有足够距离，产物长度适合 Sanger 测序或扩增子测序。引物应避开重复序列和常见 SNP，先在未编辑样本上确认单一产物。
- 7
评估编辑结果
Sanger 测序的混合峰可用 TIDE 或 ICE 拆解估计插入缺失比例，扩增子测序可用 CRISPResso2 统计各种编辑型别。单克隆需对每个等位基因分别确认，拷贝数异常的细胞系尤其要注意。
- 8
核查相似位点
对排名靠前的预测位点做扩增子测序，比较编辑组与对照组的插入缺失频率。需要更全面的结果时，可采用 GUIDE-seq、CIRCLE-seq 等实验方法，它们能发现序列预测遗漏的位置。
关键参数与决策
核酸酶与 PAM
SpCas9 的 NGG 最常见，可选位点多；SaCas9 的 PAM 更长，蛋白小便于病毒包装；Cas12a 识别富含 T 的 PAM 且位于靶序列 5 端，适合 AT 富集区。靶区没有合适 PAM 时可考虑识别范围更宽的工程变体。
在靶效率评分
各工具使用不同的训练模型，评分适合在候选之间排序，不同模型和不同细胞类型之间的绝对值不可比。评分高只说明相对更可能有效，仍需实验确认，所以建议同时测试多条候选。
特异性评分
CFD 类评分按错配的位置和类型估计单个相似位点被作用的可能性，汇总分数反映整体特异性。看汇总分数的同时必须单独检查是否存在仅零到两个错配的位点，这类位点风险远高于平均水平。
切点与编辑位点距离
用同源模板引入点突变时，目标碱基离切点越近效率越高，经验上十几个碱基以内较好，距离增加后效率明显下降。模板中通常还会同义改变 PAM 或近端碱基，避免编辑成功后再次被切。
转录调控窗口
抑制型常选转录起始位点下游数百 bp 内，激活型常选上游数百 bp 内，具体窗口按所用系统的文献报道设定。注释的起始位点可能不准，有条件时结合实验数据确认实际使用的位点。
常见错误
- 只看在靶评分不看位置：切点落在末端外显子或非关键区，移码后蛋白仍保留功能，阴性表型被误读成基因没有作用。
- 只覆盖一个转录本：存在不含该外显子的替代转录本时敲除不完全，蛋白检测仍有信号，却找不到原因。
- 忽略细胞系自身变异：靶序列或 PAM 上存在该细胞系特有的变异时，gRNA 无法正常结合，实验效率极低，而且从表型上看不出原因，排查往往要回到基因组测序数据。
- 多倍体或高拷贝细胞中只测一个等位基因：其他拷贝可能未编辑或是框内缺失，单克隆需逐个等位基因确认。
- 只做预测不做验证：序列搜索会遗漏受染色质状态等因素影响的位点，重要表型结论应至少用两条独立 gRNA 分别得到，并补做回补实验，确认表型来自目标基因。
- 用酶切错配法估算效率：这类方法对单碱基插入缺失和纯合编辑不敏感，常低估真实效率，定量优先用测序。
结果怎么看
候选 gRNA 表
每条列出间隔序列、PAM、所在链、外显子、切点坐标、在靶评分和特异性评分。优先选两类评分都不低、位于共有关键外显子的候选；在靶评分很高但落在末端外显子的要排除。
相似位点清单
按错配数和打分排列，标注是否落在基因内和是否在编码区。清单中出现零到两个错配且位于编码外显子的位点时，建议换候选；只有三个以上错配且都在远端，风险相对可控。
编辑效率报告
给出插入缺失总比例和各型别分布，以及移码占比。移码比例低而框内缺失占多数时，蛋白可能仍有功能；对照样本中出现明显插入缺失信号，说明引物或测序存在问题。
靶位点比对图
展示读段在切点附近的插入缺失分布。真实编辑的断点集中在预期切点附近几个碱基内；断点分散或偏离切点较远，提示扩增偏差或比对问题，需要回查原始数据。
和相近方法怎么选
设计工具之间的差别
CHOPCHOP 覆盖物种多、输出直观；CRISPOR 同时给出多种在靶模型评分和相似位点列表；CRISPick 侧重基于大规模筛选数据的排序。不同工具评分不一致很常见，做法是取各工具都排名靠前的候选。
序列预测与实验检测
序列预测快、覆盖全基因组，但依赖错配规则，会遗漏染色质状态等因素影响的位点。GUIDE-seq 等实验方法不预设相似性规则，结果更全面，成本和周期也更高，常用于重点品系的确认。
单基因编辑与混合文库筛选
单基因设计追求一条 gRNA 高效且特异，逐个验证基因型。混合文库筛选用成千上万条 gRNA 同时作用于细胞群体，靠每个基因多条 gRNA 的统计一致性得出结论，分析方法完全不同。
常见问题
一个基因要设计几条 gRNA？
常见做法是设计三到四条，分布在不同的共有外显子上，实验中比较效率后选最好的继续。重要结论建议用两条独立 gRNA 分别得到，一致的表型比单条 gRNA 更能排除位点特异的影响。
特异性评分低但在靶评分很高，能用吗？
要看具体的相似位点。若风险位点都落在基因间区且错配在 PAM 近端，可以在验证这些位点的前提下使用；若有位点位于其他基因编码区且错配很少，建议换候选，否则表型归因会存在争议。
敲除后蛋白还在是什么原因？
常见原因有几类：编辑型别多为框内缺失、存在不含目标外显子的转录本、细胞为多倍体而部分拷贝未编辑、起始密码子下游存在替代起始位点。按这几条逐一排查，先看测序得到的编辑型别分布。
编辑效率怎么定量？
群体水平常用 Sanger 测序配合 TIDE 或 ICE 分析混合峰，操作简便、成本低，但对低频编辑不敏感。扩增子深度测序配合 CRISPResso2 可以给出各种编辑型别的比例和移码占比，更适合需要精确数值或要区分框内与框外缺失的场合。
怎么选敲除的外显子？
优先满足三点：被所有主要转录本包含、位于编码区偏前的位置、编码关键功能域。同时避开最后一个外显子和长度为 3 的倍数的短外显子，并确认该外显子在目标物种和品系中没有已知的替代剪接。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 里说明目标基因、物种、核酸酶类型和编辑目的后，会先确认设计约束，再完成 gRNA 设计：按转录本和外显子结构确定靶区、列出符合 PAM 的候选、给出在靶效率与特异性评分并排序；随后做脱靶预测，列出相似位点及其位置和风险，并给出验证方案建议。交付候选 gRNA 表、相似位点清单、设计说明和可复现脚本。
我要在 HEK293T 里用 SpCas9 敲除人 TP53，帮我设计 4 条 gRNA，选共有外显子，并列出每条的脱靶位点和验证建议