CRISPR 筛选数据分析（MAGeCK）
混池 CRISPR 筛选把含数万条 sgRNA 的慢病毒文库导入细胞群，每个细胞大致只带一条 sgRNA，在增殖、药物处理或流式分选等选择压力下培养后，扩增测序统计每条 sgRNA 的丰度变化，反推哪些基因被扰动后影响表型。丰度下降是负选择，常见于必需基因和药物增敏基因；丰度上升是正选择，常见于耐药基因。分析核心是：从 reads 计数 sgRNA，评估覆盖和样本质量，比较处理组与对照组，再把同一基因的多条 sgRNA 汇总成基因水平的显著性。MAGeCK 是最常用的工具。
什么时候用
- 全基因组或聚焦文库敲除筛选，寻找细胞增殖必需基因
- 药物处理组与对照组比较，寻找耐药基因或增敏基因
- 按报告基因或表面蛋白高低分选细胞，找调控该表型的基因
- CRISPRi 或 CRISPRa 筛选，鉴定抑制或激活后影响表型的基因
- 多个时间点或多种处理联合分析，区分共同与条件特异命中
- 实验前规划文库：每个基因 sgRNA 数、对照比例和覆盖度
不适合的情况
- 少量 sgRNA 的阵列实验或单基因敲除验证：不需要混池统计模型
- 单细胞 CRISPR 筛选（Perturb-seq）：需要单细胞转录组分析流程
- 单条 sgRNA 的设计和脱靶评估：属于 gRNA 设计问题
需要准备的数据
- 测序数据
- FASTQ，单端即可；需知道 sgRNA 在 reads 中的位置或两侧序列，以便准确截取
- 文库文件
- sgRNA 编号、序列、对应基因三列；序列方向和长度必须与 reads 中的一致
- 样本信息
- 每个样本的分组（质粒、初始、对照、处理）、重复和时间点；MLE 还需要设计矩阵
- 对照 sgRNA
- 非靶向或靶向安全位点的 sgRNA 列表，用于标准化和估计无效应时的分布
- 参考基因集（建议）
- 公认的核心必需基因和非必需基因列表，用于评估负选择筛选的质量
分析步骤
- 1
确认 reads 结构
查看 reads 中 sgRNA 的起始位置和长度，必要时先去接头。mageck count 能自动识别 sgRNA 位置，但文库结构特殊或含错位扩增引物时，应手动指定截取参数。
- 2
sgRNA 计数
用 mageck count 输入 FASTQ 和文库文件，得到每个样本每条 sgRNA 的计数表和汇总统计。匹配比例明显偏低时，先检查截取位置和文库序列方向。
- 3
样本质控
查看每个样本的零计数 sgRNA 数、Gini 指数和总 reads，画计数分布和样本相关性。质粒或初始样本分布应集中，同组重复之间相关性应高。
- 4
筛选强度评估
负选择筛选中，用核心必需基因和非必需基因计算 ROC 或 PR 曲线，必需基因应明显富集在负选择一端；非靶向对照 sgRNA 的倍数变化应接近零。
- 5
差异检验
两组比较用 mageck test（RRA），多条件或多时间点用 mageck mle 估计每个基因在各条件下的 β 值。仔细核对处理组和对照组是否设反。
- 6
偏倚校正与定命中
检查命中是否集中在扩增的染色体区段，必要时用 CRISPRcleanR 等方法校正拷贝数带来的切割毒性；再按 FDR 和效应大小定命中，并检查同一基因多条 sgRNA 方向是否一致。
- 7
下游解读与验证
对命中基因做通路富集或蛋白互作分析，比较不同条件的 β 值找条件特异基因；挑少量基因用 2–3 条独立 sgRNA 单独验证表型。
关键参数与决策
标准化方法
mageck test 默认按中位数（median）标准化，适合多数全基因组文库；聚焦小文库中多数 sgRNA 都有效应时，这一假设不成立，改用非靶向对照 sgRNA 标准化（control）更稳妥。
RRA 还是 MLE
RRA 适合两组比较，对 sgRNA 效率差异较稳健；MLE 用广义线性模型估计 β 值，能处理多条件设计，并可估计 sgRNA 效率。条件越复杂越倾向 MLE。
命中阈值
常用基因水平 FDR 小于 0.05 或 0.1，再结合倍数变化。命中太少时不要一味放宽 FDR，先检查筛选强度，如选择压力是否足够、培养时间是否够长。
文库覆盖度
每条 sgRNA 对应的细胞数和测序 reads 决定统计能力。常见做法是转导和传代全程维持每条 sgRNA 数百倍的细胞覆盖，覆盖不足会造成随机丢失，被误判为负选择。
每基因 sgRNA 数
常见全基因组文库每个基因 4–6 条 sgRNA。数量太少时，单条无效或脱靶 sgRNA 影响很大；设计聚焦文库时可适当增加每个基因的 sgRNA 数和对照比例。
感染复数（MOI）
常用较低的 MOI（约 0.3），让多数被感染细胞只整合一条 sgRNA。MOI 过高时一个细胞带多条 sgRNA，表型无法归因到单个基因。
常见错误
- 用质粒样本作为负选择分析的对照：质粒到细胞经历病毒包装和转导偏倚，会混入结果，通常以转导后早期样本作对照更合适。
- 忽略拷贝数偏倚：Cas9 在扩增区域多处切割会引起与基因功能无关的细胞死亡，使扩增区内一批基因都被判为必需，肿瘤细胞系中尤其常见。
- 只看单条 sgRNA 大幅变化就认定命中：单条 sgRNA 可能脱靶或受测序偶然影响，基因水平需要多条 sgRNA 方向一致。
- 正选择筛选的选择压力过强：多数细胞被杀死后剩余细胞来自少数克隆，sgRNA 分布极度偏斜，随机存活被误读为耐药命中。
- 体内筛选沿用体外的覆盖度设计：移植时细胞数受限，瓶颈效应造成大量 sgRNA 随机丢失，需要更多重复和对照来区分。
- 把 RRA score 当作效应大小：它反映排序的显著性，不代表敲除效应强弱，排序和展示时应同时看倍数变化。
结果怎么看
计数汇总与质控表
各样本 reads 数、匹配比例、零计数 sgRNA 数和 Gini 指数。匹配比例明显偏低提示截取或文库文件问题；质粒或初始样本 Gini 指数偏高说明文库本身不均匀，统计能力会下降。
基因排名图或火山图
横轴为基因水平倍数变化，纵轴为显著性或排名，负选择命中在左、正选择在右。最显著的命中若集中在同一染色体区段，先怀疑拷贝数偏倚，而不是生物学信号。
sgRNA 一致性图
展示命中基因每条 sgRNA 在对照和处理中的计数变化。可信命中的多条 sgRNA 方向一致；只由一条 sgRNA 驱动的命中，需要单独验证后再下结论。
必需基因 ROC 或 PR 曲线
以核心必需基因为阳性、非必需基因为阴性，评估负选择强度。曲线接近对角线说明筛选没有形成有效选择，此时命中列表不可信，应回头检查实验。
MLE β 值散点图
两个条件下每个基因的 β 值。对角线附近的基因在两种条件下效应相同（如普遍必需基因），明显偏离对角线的才是条件特异命中，可用于寻找药物特异的耐药或增敏基因。
和相近方法怎么选
MAGeCK RRA 与 MLE
RRA 是非参数的排序聚合，设置简单，适合处理组对对照组；MLE 基于负二项模型，可同时纳入多个条件和时间点，输出各条件的 β 值。只有两组时 RRA 足够，涉及多条件比较时用 MLE。
MAGeCK 与 BAGEL
BAGEL 以参考必需与非必需基因集为训练集，计算每个基因的贝叶斯因子，专门用于判断基因是否必需，适合负选择增殖筛选；MAGeCK 更通用，可处理正选择和分选筛选。鉴定必需基因时可两者对照。
MAGeCK 与 drugZ
drugZ 专为药物-基因相互作用设计，比较同一时间点药物处理与对照的差异，并合并 sgRNA 水平的 Z 分数，增敏和耐药方向都能识别。专门寻找化学遗传相互作用时，可作为 MAGeCK 的补充。
敲除、CRISPRi 与 CRISPRa 筛选
敲除产生移码突变，效应强但受拷贝数切割毒性影响；CRISPRi 抑制转录、不切割 DNA，适合研究 lncRNA 和剂量效应；CRISPRa 寻找激活后产生表型的基因。分析流程相近，后两者的文库设计依赖转录起始位点注释。
常见问题
Gini 指数是什么，多少算正常？
Gini 指数衡量 sgRNA 计数分布的不均匀程度，0 表示完全均匀，越大越偏斜。常见经验是质粒和初始样本在 0.1 左右或更低，负选择筛选后会逐渐升高。如果某个样本明显高于同组重复，往往提示细胞覆盖不足或发生了瓶颈。
CRISPR 筛选需要多少测序深度？
常见经验是每个样本平均每条 sgRNA 有数百条 reads，同时在转导和传代中维持数百倍的细胞覆盖。测序深度再高也无法弥补细胞层面的覆盖不足；正选择或分选筛选中细胞数少，还应尽量把剩余细胞的基因组 DNA 全部用于扩增。
全基因组 CRISPR 敲除文库怎么选？
人源常用 Brunello（每基因 4 条）、GeCKO v2（每基因 6 条，分 A、B 两个半库）和 TKOv3（每基因 4 条），小鼠常用 Brie（每基因 4 条）。选择时看物种、每基因 sgRNA 数、对照比例和文库总规模，规模越大，所需细胞数和测序量越多。
MAGeCK 分析没有显著命中怎么办？
先查实验而不是放宽阈值：看必需基因是否被明显耗竭，判断筛选是否有效；检查重复间相关性、零计数比例和覆盖度；确认药物浓度和培养时间是否形成足够的选择压力。筛选本身有效但命中少时，可结合 sgRNA 一致性挑候选做验证。
CRISPR 筛选得到的命中基因如何验证？
常用 2–3 条独立 sgRNA 分别敲除，确认敲除效率后测相同表型，如竞争性增殖实验或药物敏感性实验；条件允许时用对 sgRNA 不敏感的 cDNA 回补，排除脱靶。多条 sgRNA 结果一致且能回补，命中才比较可靠。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 里，你提供 FASTQ 或计数表、文库文件和样本分组。Codar 先确认筛选类型、对照和比较方案，再做筛选质量控制（匹配率、零计数、Gini 指数、必需基因评估）和命中分析（RRA 或 MLE）；实验未开始的可先做文库设计。交付计数表、质控报告、命中基因表、火山图和可复现脚本。
这是 Brunello 文库在 A549 里的增殖筛选 FASTQ，含 Day0 和 Day21 各 3 个重复，帮我用 MAGeCK 做质控和负选择命中分析。