菌株追踪与传播分析
同一物种内部的不同菌株，在毒力、耐药和定植能力上可能差别很大。菌株追踪要回答的是：两个样本里的细菌是不是同一个菌株，它们之间是否存在传播。常见数据有两类：一是分离株全基因组测序，用核心基因组 SNP 距离或 cgMLST 等位基因差异衡量亲缘关系，常用于医院感染暴发调查和食源性疾病溯源；二是宏基因组测序，在不分离培养的情况下，从菌群数据中重建物种内的菌株差异，用于母婴传递、粪菌移植定植、家庭成员间共享等研究。距离本身不等于传播方向，传播推断还需要采样时间和流行病学接触信息。
什么时候用
- 病房内短期出现多例同一耐药菌感染，判断是否为同一克隆暴发
- 比较母亲与婴儿的肠道菌，评估菌株是否由母亲传递
- 粪菌移植后追踪供体菌株在受者体内的定植情况
- 食品、环境与患者分离株溯源，寻找共同污染来源
- 纵向采样中判断同一个体的感染是复发还是再感染
不适合的情况
- 只有 16S 扩增子数据：分辨率通常只到属或种，无法区分菌株
- 仅凭 SNP 距离小就断定 A 传给 B：距离不含方向，需结合时间与接触信息
- 跨很长时间尺度的进化研究：此时应做系统发育与分子钟分析而非同株判定
需要准备的数据
- 分离株测序数据
- Illumina 双端 FASTQ 或组装好的基因组；同一研究内测序深度应相近，深度过低会产生大量缺失位点
- 参考基因组
- 做 SNP 比对时选与研究菌株同一序列型或遗传距离最近的完成图，参考越远，可比对的核心区域越少
- 宏基因组数据
- 宿主去除后的 shotgun FASTQ；目标物种需有足够覆盖度，低丰度物种往往无法得到可靠的菌株谱
- 流行病学元数据
- 采样日期、病房、床位、入院和转科时间或家庭关系等，用于把基因组距离与可能的接触机会对应起来
分析步骤
- 1
质控与物种确认
对分离株数据做接头和低质量修剪，用 Kraken2 或 Mash 确认物种并排除污染样本，再用 mlst 确定序列型。混合菌样本的杂合位点会大量出现，在后续 SNP 调用中表现为异常多的低频位点。
- 2
比对与 SNP 调用
常用 Snippy 把各样本比对到同一参考并调用 SNP，再用 snippy-core 生成核心基因组比对。核心区域应覆盖参考的大部分；某个样本缺失位点比例明显偏高时，先检查测序深度和物种归属。
- 3
屏蔽与去除重组
屏蔽参考中的前噬菌体、插入序列和重复区，再用 Gubbins 或 ClonalFrameML 识别重组区段。重组可以一次引入成百个 SNP，不去除会让本属同一克隆的菌株看起来距离很远。
- 4
计算 SNP 距离
用 snp-dists 等工具得到两两 SNP 距离矩阵，并画距离分布图。同一暴发内的距离通常集中在很小的范围，与背景菌株形成明显分隔；如果分布连续没有断点，阈值判定需要更谨慎。
- 5
构建系统发育树
以去除重组后的核心 SNP 比对用 IQ-TREE 或 RAxML 构树，并在树旁标注采样时间、科室和耐药基因。暴发株应聚成紧密的单系分支，分支内部长度短。
- 6
结合流行病学推断
把基因组簇与住院时间线叠加，检查簇内患者是否有时间和空间上的重叠。需要推断谁传给谁时，可用 TransPhylo、outbreaker2 等结合采样时间和突变速率的模型，结果以概率表达。
- 7
宏基因组菌株分析
没有分离株时，用 StrainPhlAn 基于物种标记基因重建优势菌株序列并计算距离，或用 inStrain 比对到参考基因组计算 popANI。比较前确认两个样本对目标物种的覆盖度和可比较区域都足够。
关键参数与决策
同株 SNP 阈值
没有通用阈值，取决于物种的突变速率、采样时间跨度和是否去除重组。常见做法是参考同物种已发表暴发研究，并结合本研究距离分布中暴发株与背景株之间的断点来确定。
SNP 调用过滤
通常要求位点有足够深度和高等位基因频率，Snippy 用 --mincov 和 --minfrac 控制，常见设置为深度至少 10、变异比例 0.9 左右。放宽会引入测序错误，过严会在低深度样本中丢失真实差异。
cgMLST 与 SNP 方案
cgMLST 以等位基因为单位计数差异，命名标准化、便于不同实验室共享比较；SNP 方案分辨率更高。常见做法是先用 cgMLST 快速聚类，再在可疑簇内做高分辨率 SNP 分析。
宏基因组同株标准
inStrain 文档建议以 popANI 不低于 99.999% 作为同株判定的经验值；StrainPhlAn 研究常用无关个体间距离分布的低百分位作为物种特异阈值。两者都要求比较区域覆盖充分。
常见错误
- 用遗传距离较远的参考基因组：核心比对区域大幅缩小，真实差异落在未比对区域，SNP 距离被低估。
- 不去除重组就计算距离：一次重组带入的大量 SNP 会把同一传播链中的菌株错误地拆成不同簇。
- 忽视质粒介导的传播：耐药基因可以在不同菌株甚至不同物种之间通过质粒扩散，染色体 SNP 距离大并不排除质粒传播。
- 直接比较不同参考或不同流程得到的 SNP 距离：参考、过滤和屏蔽策略不同，距离数值没有可比性。
- 宏基因组中把低覆盖样本判为不同菌株：可比较位点不足时 ANI 估计不稳定，应标记为无法判断而不是不同株。
结果怎么看
SNP 距离矩阵热图
每格是两样本间的 SNP 数，按聚类排序后疑似暴发株会形成低距离方块。方块边界清晰说明簇划分可信；如果方块内部仍有部分距离接近背景水平，提示可能混入了不同来源的菌株。
距离分布直方图
将所有两两距离画成分布，同一暴发的距离聚在左侧低值区，无关菌株分布在右侧。两组之间存在明显空档时阈值容易确定；呈连续分布时应报告多个阈值下的结果。
带注释的系统发育树
叶节点按科室、采样日期和耐药基因着色。暴发株应形成短分支的紧密分支；同一分支内跨越很长时间或很多科室时，提示存在持续的环境储存库或长期定植。
传播网络与时间线
节点为患者或样本，边表示距离低于阈值或模型推断的传播概率，旁边配合住院时间线。没有时间重叠却距离很近的病例，可能通过共同环境或未采样中间人相连。
和相近方法怎么选
核心基因组 SNP 与 cgMLST
cgMLST 把每个核心基因的不同序列视为一个等位基因，一个基因内多个突变只计一次差异，方案标准化、适合跨机构监测。核心 SNP 逐位点计数，分辨率更高，适合判断小范围暴发中的细微差异。
分离株 WGS 与宏基因组菌株分析
分离株测序得到完整基因组，距离精确，但每个样本只能代表挑出的少数菌落。宏基因组无需培养，能同时看多个物种，但只能可靠地重建优势菌株，低丰度菌株和同种多株混合时分辨率有限。
菌株追踪与群落多样性分析
β 多样性比较的是整个群落的组成相似度，两个人菌群相似不代表共享相同菌株。菌株追踪落到单一物种内部的遗传差异，才能回答菌株是否在个体之间传递。
常见问题
SNP 距离多少算同一菌株？
没有适用于所有细菌的统一标准。不同物种突变速率不同，采样时间跨度越长允许的距离越大，是否去除重组也会影响数值。建议参考同物种的暴发研究，并结合本数据距离分布中的断点确定，在文中写明阈值依据。
Gubbins 一定要做吗？
对重组频繁的物种，如肺炎链球菌，去除重组非常重要；对克隆性较强的物种影响相对较小，但仍建议运行并比较去除前后的距离。重组去除需要足够多的样本和合理的全基因组比对，样本很少时效果有限。
宏基因组数据能做菌株追踪吗？
可以，常用 StrainPhlAn 和 inStrain。前提是目标物种在两个样本中都有足够覆盖度，并且样本中该物种以一个优势菌株为主。多个菌株混合时，重建的序列可能是混合信号，需要结合位点多态性判断。
菌株追踪结果能直接用于感染控制决策吗？
这类分析属于科研与流行病学调查辅助，不能替代临床诊断和感控部门的正式判定。基因组结果应与流行病学调查、接触史和现场采样一起评估，单独的低 SNP 距离只能提示可能存在传播。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 里提供分离株测序数据或宏基因组数据及采样元数据后，会先确认物种、参考基因组和同株判定标准，再完成菌株追踪与传播分析：比对和变异调用、两两遗传距离计算、系统发育树构建，并结合采样时间与地点整理可能的传播关系。交付距离矩阵、注释系统发育树、传播网络图、报告和可复现脚本。
我有某 ICU 半年内 30 株耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的 WGS 数据和住院时间表，想算 SNP 距离并判断是否存在院内传播