TWAS 转录组关联分析
转录组关联分析（TWAS）把 GWAS 的位点层面信号转换到基因层面。思路是先在同时有基因型和表达数据的参考队列（如 GTEx）中，为每个基因训练一个由附近 cis 区域 SNP 预测表达量的模型，再把这些权重应用到 GWAS 数据上，检验遗传预测的表达量是否与性状相关。由于只用汇总统计和 LD 参考就能完成，FUSION 和 S-PrediXcan 成为最常用的两套工具，前者使用多种模型并选最优，后者使用 PredictDB 提供的预训练模型。TWAS 的价值在于减少检验次数、把非编码 GWAS 信号连接到候选基因和组织；但它检验的是相关，同一位点附近多个共享 eQTL 的基因可能同时显著，因此需要条件分析、精细定位或共定位帮助缩小范围。
什么时候用
- 已有 GWAS 汇总统计，想把显著位点对应到可能的效应基因
- 希望找到 GWAS 未达到全基因组显著但在基因层面显著的信号
- 想知道性状相关的遗传调控主要发生在哪些组织
- 为后续实验挑选候选基因，按表达方向推测上调或下调的影响
- 多个组织模型结果需要合并，提高检出效力
不适合的情况
- 参考队列与 GWAS 人群祖源差异很大：表达预测准确性下降，LD 不匹配会产生偏差
- 目标基因在参考组织中几乎不表达或没有显著 cis 遗传力：无法训练可用模型
- 把 TWAS 显著直接写成该基因表达导致疾病的因果结论
需要准备的数据
- GWAS 汇总统计
- 需含 SNP 编号、效应等位基因、另一等位基因及 Z 值或 beta 与标准误；基因组版本须与权重文件一致。
- 表达预测权重
- FUSION 用其提供的各组织权重，S-PrediXcan 用 PredictDB 模型和配套协方差，不能混用。
- LD 参考面板
- FUSION 需要与 GWAS 人群祖源匹配的 PLINK 格式参考，如 1000 Genomes 对应人群子集。
- 组织选择依据
- 已知疾病相关组织或通过遗传力富集等分析得到的候选组织，用于确定主分析组织和需要校正的检验数。
分析步骤
- 1
整理汇总统计
统一列名，计算 Z 值，去除缺失、重复和链模糊的 SNP。可用 LDSC 的 munge_sumstats 完成标准化；整理后保留的 SNP 应能与权重中的大部分 SNP 匹配。
- 2
等位基因对齐
确保 GWAS 效应等位基因与权重文件参考的等位基因一致，方向翻转时 Z 值取负。FUSION 和 S-PrediXcan 会自动做部分对齐，但版本或 SNP 编号不一致时匹配率会显著下降。
- 3
选择组织和模型
根据疾病生物学和数据可用性选择一个或多个组织。权重通常已按 cis 遗传力或交叉验证预测表现过滤，可在结果中记录每个基因所用模型和预测表现。
- 4
运行关联检验
FUSION 按染色体运行关联脚本，输出 TWAS 的 Z 值和 P 值；S-PrediXcan 用 SPrediXcan.py 输出每个基因的 zscore 和 P 值。检查有多少基因因 SNP 匹配不足被跳过。
- 5
多重检验校正
常用 Bonferroni 校正，阈值为 0.05 除以实际检验的基因-组织对数。多组织分析时检验数显著增加，也可用 S-MultiXcan 合并组织后按基因数校正。
- 6
条件分析与共定位
同一区域多个基因显著时，用 FUSION 的条件分析判断哪些基因的信号在控制其他基因后仍存在；再对候选基因做 GWAS 与 eQTL 共定位，排除由不同变异连锁造成的假关联。
- 7
结果整理
汇总显著基因、所在区域、效应方向、组织和是否与已知 GWAS 位点重叠。区分新发现的基因层面信号和已报道位点内的基因，为后续实验验证排序。
关键参数与决策
组织选择
与疾病机制相关的组织优先，例如脑相关性状选择脑区组织。相关组织样本量小时模型基因数少，可补充样本量大的组织作为替代，但解释时需要说明组织特异性受限。
表达预测模型类型
FUSION 会比较 top1、LASSO、弹性网络、BLUP 等模型，选择交叉验证表现最好的一个；PredictDB 提供弹性网络和 MASHR 等版本，各版本的 SNP 编号格式和协方差文件需配套使用。
显著性阈值
按实际检验的基因-组织数做 Bonferroni 校正最常见，也有研究使用 FDR。报告时写明检验总数和所用阈值，便于读者判断结果的严格程度。
SNP 匹配率
权重中有效 SNP 在 GWAS 中缺失过多时，预测表达不完整，检验效力下降。经验上应检查整体匹配率，必要时先对 GWAS 汇总统计做填充，或使用与之版本一致的权重。
共定位后验阈值
共定位常看两个性状共享同一因果变异的后验概率 PP.H4，较高时支持同一信号。阈值依研究设定，经验上常以 0.8 作为较强证据。
常见错误
- GWAS 与权重使用不同基因组版本：大量 SNP 无法匹配，结果中很多基因被跳过，显著基因数异常偏少。
- LD 参考祖源与 GWAS 人群不一致：权重 SNP 间相关性估计错误，Z 值方差失真，造成假阳性或假阴性。
- 只报告 P 值最小的基因作为致病基因：同一区域共享 eQTL 的多个基因都会显著，未做条件分析时无法区分。
- 多组织结果合并后仍按单组织基因数校正：实际检验次数被低估，假阳性率上升。
- 忽视 HLA 等高度多态和长程 LD 区域：这些区域的 TWAS 信号很难解释，常需要单独处理或在结果中标注。
- 用不同来源的模型和协方差文件混跑 S-PrediXcan：SNP 权重与协方差不对应，得到的 Z 值不可信。
结果怎么看
TWAS 曼哈顿图
横轴是基因在染色体上的位置，纵轴是负对数 P 值，每个点是一个基因或基因-组织对。显著基因簇集中出现的位置通常对应已知 GWAS 位点，单独出现的显著基因可能是新的基因层面信号。
显著基因结果表
列出基因、组织、TWAS Z 值、P 值、所用模型和预测表现。Z 值正负表示遗传预测表达升高与性状风险升高或降低相关；模型预测表现很低的基因，结果需谨慎解读。
条件分析区域图
展示某区域 GWAS 信号在条件于 TWAS 显著基因前后的变化。条件后 GWAS 信号大幅减弱，说明该基因预测表达能解释大部分关联；信号仍保留则提示存在其他独立机制。
多组织热图
行是基因，列是组织，颜色为 TWAS Z 值。在相关组织中一致显著且方向一致的基因证据较强；仅在单一无关组织中显著，可能源于 eQTL 共享或组织模型偶然性。
和相近方法怎么选
TWAS 与共定位分析
TWAS 检验遗传预测表达与性状是否相关，基因层面检验次数少、效力高，但会受 LD 和多基因共享 eQTL 影响；共定位检验两个信号是否由同一变异驱动。常先用 TWAS 筛选候选基因，再用共定位确认，两者结合更可靠。
TWAS 与孟德尔随机化
TWAS 本质上可视为以多个 cis-eQTL 为工具变量的一种关联检验，但不系统检验多效性；孟德尔随机化提供多种敏感性分析来评估因果假设。想对少量候选基因做因果推断时，可用 cis-eQTL 进一步做 MR。
FUSION 与 S-PrediXcan
FUSION 自带多种模型选择、条件分析和共定位接口，需要提供 LD 参考；S-PrediXcan 使用 PredictDB 预训练模型和配套协方差，运行简便，并有 S-MultiXcan 合并多组织。两者结论多数情况下相近，可互作验证。
常见问题
TWAS 和 GWAS 有什么区别？
GWAS 逐个检验 SNP 与性状的关联，TWAS 把基因附近多个 SNP 按表达预测权重组合，检验基因预测表达与性状的关联。TWAS 检验次数少，结果直接落在基因上，但依赖参考组织的表达模型，无法覆盖不受 cis 调控的基因。
TWAS 显著的基因就是致病基因吗？
不一定。同一区域内多个基因可能共享 eQTL 而同时显著，GWAS 信号也可能与 eQTL 由不同变异驱动。需要结合条件分析、共定位、精细定位以及功能实验，才能更有把握地确定效应基因。
FUSION 需要准备哪些文件？
需要整理成 SNP、A1、A2、Z 四列的 GWAS 汇总统计，对应组织的权重文件和权重列表，以及按染色体拆分的 PLINK 格式 LD 参考。所有文件的 SNP 编号和基因组版本需要一致。
应该选哪些组织做 TWAS？
优先选择与疾病机制直接相关的组织，也可借助 LDSC 分组织遗传力富集等方法确定候选组织。不确定时可以跑多个组织，再用 S-MultiXcan 或分组织结果比较，但要相应调整多重检验校正。
TWAS 结果显示的 Z 值方向怎么理解？
正的 Z 值表示遗传预测表达越高，效应等位基因方向上的性状值或患病风险越高；负值则相反。方向依赖效应等位基因定义正确，对齐出错会使所有方向颠倒，因此等位基因对齐是必须检查的步骤。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 里提供 GWAS 汇总统计并说明人群祖源和关注的组织后，会先确认分析方案，然后整理汇总统计并与表达预测权重做等位基因对齐，选择组织运行 TWAS 关联检验，按实际检验数做多重校正，对同区域多个显著基因做条件分析。交付显著基因结果表、TWAS 曼哈顿图、多组织结果图、分析报告和可复现脚本。
我有一份欧洲人群冠心病 GWAS 汇总统计（hg38），想用 GTEx 的动脉和肝脏组织做 TWAS，找出可能的效应基因