cfDNA 片段组学分析
血浆中的游离 DNA（cfDNA）主要来自细胞凋亡，DNA 在核小体之间被切断，因此片段长度集中在约 167 bp，相当于一个核小体加连接区，更短的片段呈约 10 bp 的周期起伏。来自肿瘤的 cfDNA 往往更短，在基因组上的断裂位置、末端序列和核小体占位也与正常来源不同。片段组学就是利用这些不依赖突变的特征：片段长度分布、按区间统计的短长片段比、片段末端的 4 碱基基序、转录起始位点和转录因子结合位点附近的核小体足迹等。代表性方法 DELFI 在低深度全基因组测序上计算全基因组碎片谱，再用机器学习区分癌症与非癌症。典型数据是双端低深度血浆 WGS。本页介绍科研分析方法，结果不能用于个人癌症筛查或诊断。
什么时候用
- 用低深度血浆 WGS 构建癌症与非癌症的分类模型
- 在没有肿瘤组织或已知突变时，寻找不依赖突变的 ctDNA 信号
- 通过核小体足迹推断 cfDNA 的组织来源或基因表达状态
- 比较不同疾病、不同时间点血浆的片段长度和末端基序差异
- 把片段特征与拷贝数、甲基化特征结合，提高多组学模型表现
不适合的情况
- 单端测序数据：无法得到每个片段的真实长度，大部分特征无法计算
- 需要定位具体突变用于用药或复发监测，应选择突变检测和 MRD 流程
- 采血管类型和处理时间混杂且无记录的回顾性样本，批次难以校正
需要准备的数据
- 血浆 cfDNA WGS 数据
- 双端测序的 FASTQ 或 BAM，低深度即可计算全基因组特征；核小体足迹等精细特征需要更高深度或多样本合并
- 样本处理信息
- 采血管类型、采血到分离血浆的时间、离心方式、提取试剂盒，这些因素会改变片段分布，必须记录
- 文库与测序信息
- 建库方法（双链或单链）、是否片段筛选、PCR 循环数和测序批次，用于识别和校正技术批次
- 分组与临床信息
- 癌症类型、分期、对照人群的年龄性别和合并症，用于模型训练和混杂因素匹配
分析步骤
- 1
比对与过滤
双端比对到参考基因组，去除 PCR 重复，只保留正确配对、比对质量较高的片段，并排除黑名单区域。由配对两端位置计算片段长度，这是后续所有特征的基础。
- 2
检查片段长度分布
画出每个样本的片段长度分布，应在约 167 bp 处有主峰，并在其下方看到约 10 bp 的周期性小峰。出现大量数百 bp 以上的长片段，提示白细胞裂解等基因组 DNA 污染。
- 3
计算碎片谱
按 DELFI 的思路把基因组分成 Mb 级区间，统计每个区间短片段和长片段的数量与比值，并做片段层面的 GC 校正。正常样本之间的碎片谱应高度相关，癌症样本通常偏离更大。
- 4
提取末端基序
统计每个片段 5′ 端的 4 碱基序列频率，并计算基序多样性等汇总指标。末端基序受建库酶处理影响，比较前需确认所有样本使用同一建库方法。
- 5
核小体足迹分析
在转录起始位点或特定转录因子结合位点周围汇总覆盖度和片段中心位置，活跃基因启动子处覆盖下降更明显。可用于推断组织来源，常需较高深度或按组合并样本。
- 6
构建分类模型
把各类特征合并后用梯度提升、逻辑回归等模型训练，采用嵌套交叉验证调参，并保留独立测试集。对照组应在年龄、性别、采血中心等方面与病例组匹配。
- 7
评估与解释
报告 ROC 曲线、AUC 及置信区间，以及在预设特异度下的灵敏度，并按分期和癌种分层。用特征重要性检查模型是否主要依赖批次相关特征，必要时在外部队列验证。
关键参数与决策
短片段与长片段的长度界限
DELFI 原方法把约 100 到 150 bp 计为短片段、约 151 到 220 bp 计为长片段。换用其他界限会改变比值的灵敏度，应在训练集中确定后固定不变，不能在测试集上调整。
区间大小
全基因组碎片谱常用 Mb 级区间，区间越小分辨率越高，但每个区间的片段数更少、噪声更大。低深度数据宜用较大区间，并确认每个区间的片段数足够。
GC 与比对质量校正
片段长度与 GC 含量相关，GC 偏好会在短长片段比中产生伪信号。常在片段层面按 GC 分层校正，并设置比对质量阈值去除重复区的错误比对。
测序深度
全基因组碎片谱和拷贝数特征在低深度下即可稳定估计，核小体足迹和末端基序的精细分析需要更多片段。深度差异大的样本应下采样到相近水平再比较。
模型验证方案
特征多而样本少时极易过拟合，应使用嵌套交叉验证和独立外部测试集，并在不同中心或批次间交叉验证，确认模型不是在区分批次。
常见错误
- 病例和对照来自不同采血管或处理流程：片段分布被处理条件显著改变，模型可能只学会区分来源，外部验证时效果大幅下降。
- 忽视白细胞基因组 DNA 污染：采血后放置过久会释放长片段 DNA，稀释肿瘤信号并改变碎片谱，需检查长片段比例并剔除异常样本。
- 双链与单链文库数据混合比较：单链建库能回收更多 100 bp 以下的短片段，末端基序也不同，混用会产生系统差异。
- 不做片段层面的 GC 校正：GC 偏好随批次波动，会在短长片段比中形成与疾病无关的区间信号。
- 在全部样本上选特征再做交叉验证：特征选择泄露了测试集信息，交叉验证 AUC 会被明显高估。
- 用晚期病例训练却宣称适用于早筛：晚期肿瘤分数高、信号强，模型在早期病例中的表现可能差很多，应按分期分别报告。
结果怎么看
片段长度分布图
横轴为片段长度，纵轴为比例，多样本叠加显示。主峰应在约 167 bp，病例组可能在更短片段处比例升高；个别样本主峰偏移或长片段尾部明显，提示处理问题。
全基因组碎片谱
按染色体排列的各区间短长片段比，病例与对照分组展示。对照样本曲线应高度一致；某些病例的局部偏离与拷贝数改变区域吻合时，说明信号部分来自拷贝数。
末端基序与核小体足迹图
末端基序频率热图或多样性指标箱线图，以及转录起始位点周围的覆盖曲线。足迹图中启动子处覆盖下降越深，代表该类基因越活跃，可与组织表达谱对照。
模型性能图
ROC 曲线、AUC 置信区间及固定特异度下的灵敏度，按分期和癌种分层。早期灵敏度明显低于整体、或外部队列 AUC 大幅下降，说明模型泛化能力有限。
和相近方法怎么选
片段组学与 ctDNA 突变检测
突变检测依赖已知或可检出的体细胞突变，特异性高但在肿瘤分数很低时受限于突变数量；片段组学利用全基因组数以百万计的片段，不需要突变信息，成本低，但信号间接、易受处理批次影响。
片段组学与 cfDNA 甲基化
甲基化特征组织特异性强，更适合溯源，但需要亚硫酸氢盐或酶法转换建库；片段组学用普通低深度 WGS 即可，成本更低。两者可以在同一样本上联合，互为补充。
片段组学与 ichorCNA 肿瘤分数估计
ichorCNA 利用低深度 WGS 的拷贝数改变估计肿瘤分数，适合拷贝数改变明显的肿瘤；片段组学还包含片段长度和末端特征，对拷贝数平稳的肿瘤也可能有信号。两者常从同一数据中一起计算。
常见问题
cfDNA 片段长度为什么集中在 167 bp？
cfDNA 主要来自细胞凋亡，DNA 在核小体之间被核酸酶切断，留下包绕一个核小体的约 147 bp 核心 DNA 加上一段连接 DNA，合计约 167 bp。低于主峰的约 10 bp 周期，反映 DNA 螺旋在核小体表面的切割位置。
DELFI 方法是怎么做的？
DELFI 对血浆 cfDNA 做低深度全基因组测序，把基因组分成 Mb 级区间，计算每个区间短片段与长片段的比值，形成全基因组碎片谱，再结合其他特征用机器学习模型区分癌症与非癌症。
片段组学需要多少测序深度？
全基因组碎片谱和拷贝数类特征通常在低深度 WGS 上即可计算，这也是该方法成本低的原因。核小体足迹、单个位点的末端分析需要更多片段，可提高深度或在同组样本间合并。具体深度应结合特征类型预先评估。
为什么肿瘤来源的 cfDNA 更短？
目前认为与肿瘤细胞的染色质结构、核小体包装和核酸酶活性差异有关，肿瘤片段长度分布整体左移，短于主峰的片段比例增加。因此按长度筛选短片段可以在一定程度上富集 ctDNA 信号。
采血管类型会影响片段组学吗？
会。普通 EDTA 管放置时间过长，白细胞裂解会释放长片段基因组 DNA；细胞稳定型采血管能延缓这一过程。不同采血管和处理时间会改变片段分布，研究中病例与对照的处理流程应保持一致。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 里提供血浆 cfDNA 双端 WGS 数据和分组信息，说明采血与建库条件。Codar 确认方案后完成比对过滤和质控，计算片段长度分布、全基因组短长片段碎片谱、末端基序和核小体足迹等片段组学特征，并按分组比较或构建分类模型。交付片段分布图、碎片谱、特征矩阵、模型评估结果、报告和可复现脚本。
我有 150 例肺癌和 150 例对照的血浆低深度 WGS，帮我算 DELFI 式片段特征和末端基序，建分类模型并按分期报告灵敏度