cfDNA 甲基化分析：早筛模型与组织溯源
血浆游离 DNA（cfDNA）来自全身细胞凋亡和坏死释放的 DNA 片段，其中肿瘤来源的部分称为 ctDNA。不同组织和细胞类型的 CpG 甲基化模式差异稳定，而肿瘤又常在特定区域出现异常高甲基化，因此 cfDNA 甲基化可以同时回答两个问题：样本里有没有肿瘤信号，以及这些信号可能来自哪个组织。常见数据包括全基因组或靶向亚硫酸氢盐测序、酶法转化测序（如 EM-seq）、cfMeDIP-seq 富集测序和简化代表性测序。分析的核心是在占绝对多数的白细胞背景中，稳定地识别比例很低的肿瘤或组织特异甲基化信号。本页内容属于科研分析方法，不替代临床筛查、诊断或治疗决策。
什么时候用
- 比较癌症患者与健康对照血浆，筛选差异甲基化区域作为候选标志物
- 构建癌症与非癌分类模型，评估在高特异性下的灵敏度
- 用参考甲基化图谱估计 cfDNA 中各组织或细胞类型的来源比例
- 多癌种队列中预测阳性样本的可能来源器官
- 器官损伤、移植或妊娠研究中追踪特定组织来源 DNA 的变化
不适合的情况
- 只有血浆点突变数据，没有甲基化测序时，应改用突变或片段组学方法
- 样本量很小又没有独立验证集时，不宜宣称模型可用于早筛
- 需要绝对定量单个基因启动子甲基化时，靶向 PCR 类方法往往更直接
需要准备的数据
- 甲基化测序原始数据
- FASTQ 文件，需注明建库方式（亚硫酸氢盐、酶法转化或 MeDIP），比对软件和参数随建库方式不同
- 样本分组与临床信息
- 癌症类型、分期、健康或良性对照、年龄性别、采血批次；分期信息决定能否分层报告灵敏度
- 参考甲基化图谱
- 纯化细胞类型或正常组织的甲基化数据，用于组织溯源；需与样本使用同一参考基因组和区域定义
- 目标区域文件
- 靶向 panel 的 BED 文件或候选差异区域列表，用于统计覆盖和构建特征
分析步骤
- 1
质控与修剪
用 fastp 或 Trim Galore 去除接头和低质量碱基，靶向或酶法文库注意按说明书裁剪末端偏好碱基。查看 M-bias 图，若读段两端甲基化水平明显偏离中段，需要额外裁剪这几个位置。
- 2
比对与去重
亚硫酸氢盐数据常用 Bismark 或 bwa-meth 比对，随后去除 PCR 重复；带 UMI 的文库按 UMI 去重。cfDNA 起始量低，重复率偏高是常见现象，但去重后有效深度过低的样本应剔除。
- 3
转化率与覆盖评估
用 lambda 等未甲基化 spike-in 或人类非 CpG 位点甲基化率估计转化效率，转化不完全会让所有位点甲基化水平虚高。同时统计目标区域覆盖深度和均一性。
- 4
提取甲基化特征
用 MethylDackel 或 Bismark 的提取工具得到每个 CpG 的甲基化读数。除区域平均甲基化率外，读段水平特征（如整条读段全部甲基化的比例）对低比例肿瘤信号更敏感。
- 5
筛选差异区域
在训练集内比较癌症与对照，同时排除在白细胞中本来就高甲基化的区域，否则信号会被血细胞背景淹没。特征筛选必须只在训练集里做。
- 6
构建分类模型
用逻辑回归、随机森林或带正则化的模型训练，采用嵌套交叉验证调参。报告在预设特异性下的灵敏度和 AUC，并按分期、癌种分层给出结果。
- 7
组织溯源解卷积
以参考图谱中各细胞类型的特异甲基化区域为基矩阵，用非负最小二乘等方法估计样本中各来源的比例。健康人样本应以血细胞来源为主，可以作为方法自检。
- 8
独立验证与解读
在不同时间或中心采集的独立队列上验证，比较训练与验证性能差距。差距过大通常说明过拟合或批次信号被模型学到。
关键参数与决策
建库方式
亚硫酸氢盐转化会降解 DNA，对本就低量的 cfDNA 损失较大；酶法转化保留更多分子；MeDIP 只给出富集信号而非单碱基甲基化率。分析方法和特征定义要随之调整。
特征层级
可以用单个 CpG、区域平均值或读段水平模式。肿瘤 DNA 比例很低时，区域平均值容易被稀释，统计含有完整异常甲基化模式的读段比例通常更敏感。
最低覆盖深度
单个 CpG 深度过低时甲基化率波动很大。常见做法是设定位点或区域的最低读数门槛，并检查过滤后各组样本保留的特征数量是否接近。
特异性目标
筛查场景中假阳性代价高，常以高特异性（如 99%）下的灵敏度报告性能。阈值必须在训练集内确定，再原样应用到验证集。
参考图谱的细胞类型
解卷积只能识别图谱中已有的类型。图谱缺少相关组织时，其信号会被分配给相近类型，因此要根据研究问题补全参考类型。
常见错误
- 在全部样本上先筛差异区域再做交叉验证：特征选择已经看过测试样本，AUC 会被严重高估，独立验证时性能大幅下降。
- 癌症组与对照组采血时间、处理流程或测序批次不同：模型可能学到批次差异而非肿瘤信号，表现为验证队列中性能突然下降。
- 忽略转化效率差异：转化率偏低的样本整体甲基化水平升高，可能被误判为高甲基化阳性，应在质控阶段剔除或校正。
- 血浆分离延迟导致白细胞裂解：大量长片段基因组 DNA 混入，稀释肿瘤信号，并改变解卷积中血细胞比例。
- 对照组只有年轻健康人：年龄、炎症和良性疾病都会影响 cfDNA 组成，缺少良性病对照会高估模型在真实人群中的特异性。
- 把晚期患者为主的队列结果外推到早筛：早期肿瘤 ctDNA 比例更低，灵敏度通常显著低于晚期，应按分期报告。
结果怎么看
M-bias 与转化率图
M-bias 图显示读段各位置的甲基化水平，正常应基本平坦，两端翘起说明需要裁剪。非 CpG 甲基化率反映转化效率，个别样本明显偏高时应剔除。
差异甲基化区域热图
行是区域、列是样本，按组排序。理想情况是癌症样本在少数区域呈现一致升高；如果热图按批次而不是按组分块，说明批次效应主导了差异。
ROC 曲线与分期灵敏度表
看整体 AUC，更要看预设特异性下的灵敏度和各期灵敏度。交叉验证与独立验证的曲线差距大，提示模型过拟合。
组织来源比例堆叠图
每个样本一根柱，展示各组织来源比例。健康对照应以中性粒细胞、淋巴细胞等血细胞为主；癌症样本中对应器官比例升高才有溯源意义。
溯源混淆矩阵
行为真实癌种，列为预测来源。对角线比例越高越好；相邻器官之间（如消化道各段）常相互混淆，需要结合参考图谱判断是否可区分。
和相近方法怎么选
cfDNA 甲基化与片段组学
甲基化直接反映细胞类型身份，适合溯源；片段组学利用片段长度、末端基序和覆盖模式，只需低深度 WGS，成本较低。两者常联合使用，片段组学更适合作为补充特征而非单独溯源。
cfDNA 甲基化与 ctDNA 突变检测
突变检测特异性高，可用于已知肿瘤的 MRD 监测，但早筛时突变位点不确定，且受克隆性造血干扰。甲基化在同一癌种中更一致，更适合未知肿瘤的筛查与溯源。
cfDNA 甲基化与组织甲基化芯片分析
组织芯片样本肿瘤含量高，适合发现候选区域；cfDNA 中信号被大量稀释，需要读段水平特征和更严格的背景过滤。组织结果常作为 cfDNA 分析的先验区域来源。
常见问题
cfDNA 甲基化做早筛需要多大测序深度？
取决于建库方式和肿瘤信号比例。全基因组亚硫酸氢盐测序通常深度有限，更多用于探索；靶向 panel 可以在关键区域达到很高深度，更适合检测低比例信号。实际应以去重后有效深度和目标区域覆盖为准，而不是原始数据量。
组织溯源的参考图谱从哪里来？
常用来源是纯化细胞类型或正常组织的公开甲基化数据，也可以用 TCGA 等肿瘤组织数据补充癌种特异区域。关键是参考数据与样本使用同一参考基因组和区域定义，并包含研究关心的所有组织类型。
cfMeDIP-seq 数据可以做组织溯源吗？
可以，但它给出的是富集读数而非单碱基甲基化率，通常用区域计数或基于富集数据的模型推断甲基化状态，再与参考数据比较。参考图谱如果来自亚硫酸氢盐测序，需要注意两种数据尺度不一致的问题。
模型 AUC 很高，是否说明能用于临床筛查？
不能直接下这个结论。高 AUC 可能来自晚期病例比例高、对照不包含良性病，或者批次与分组混杂。需要在独立、前瞻性、符合目标人群的队列中验证，并报告高特异性下各期灵敏度。
健康人 cfDNA 的组织来源比例是什么样的？
多数研究报告健康人血浆 cfDNA 主要来自造血细胞，尤其是中性粒细胞和淋巴细胞等，其他组织占比较小。如果健康对照中某个实体器官比例明显升高，应检查参考图谱、样本质量或受试者是否存在其他疾病。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 中描述你的血浆甲基化数据和研究目标后，会先确认建库方式、分组和参考图谱方案，然后完成从比对、甲基化提取、质控到差异区域筛选、分类模型构建和组织溯源解卷积的流程。交付内容包括质控报告、差异区域表、ROC 曲线与分期灵敏度表、组织来源比例图，以及可复现的分析脚本。
我有 60 例结直肠癌和 60 例健康人的血浆靶向甲基化测序 FASTQ，想筛出差异区域、建分类模型，并估计 cfDNA 的组织来源比例。