ctDNA 肿瘤分数估计（ichorCNA）
肿瘤分数（tumor fraction）指血浆 cfDNA 中来自肿瘤细胞的 DNA 比例。肿瘤常有大片段拷贝数改变，这些改变会让血浆测序的覆盖深度在对应区域出现轻微而一致的升降，偏离幅度与肿瘤分数成正比。ichorCNA 利用这一原理，基于隐马尔可夫模型同时推断拷贝数分段、肿瘤分数和倍性，只需要深度约 0.1x 的超低深度全基因组测序（ULP-WGS），成本很低。它常用于判断样本是否有足够 ctDNA 进入后续深度测序、随访中追踪肿瘤负荷，以及在全外显子测序前筛选样本。本页内容属于科研分析，不替代临床诊断或治疗决策。
什么时候用
- 在做血浆 WES 或深度测序前，筛选肿瘤分数足够高的样本
- 晚期患者治疗前后连续采样，追踪 ctDNA 负荷变化
- 大队列中以低成本得到每个样本的肿瘤分数与全基因组拷贝数概貌
- 比较血浆与组织的拷贝数图谱，评估两者一致性
- 需要不依赖已知突变位点的肿瘤信号定量
不适合的情况
- 早期肿瘤或术后微小残留病灶，肿瘤分数常低于方法检测下限
- 拷贝数改变很少的肿瘤类型，缺少可用信号，估计结果不可靠
- 需要检测具体点突变或融合时，应使用靶向或全外显子测序
需要准备的数据
- 血浆 cfDNA BAM
- 低深度 WGS 比对文件，常见深度约 0.1x；需去重并保留比对质量信息，参考基因组与 ichorCNA 配套文件版本一致
- 健康人血浆 BAM
- 用于构建正常样本面板（PoN），最好与待测样本同一建库试剂和测序平台，数量越多去噪效果越稳定
- GC 与可比对性文件
- 与分箱大小和参考基因组对应的 GC 含量、mappability 及着丝粒文件，ichorCNA 软件包提供常用版本
- 样本信息
- 性别、采样时间、治疗时间点；性别影响 X 染色体处理，时间点用于纵向比较
分析步骤
- 1
比对与去重
用 BWA-MEM 等比对到参考基因组并去除 PCR 重复，统计去重后读数。读数过少时分箱计数噪声大，分段会变得零碎，这类样本应标记或补测。
- 2
分箱计数
用 HMMcopy 的 readCounter 按固定窗口（常用 1 Mb）统计读数并生成 WIG 文件，只保留足够比对质量的读段。所有样本使用同一窗口大小和染色体集合。
- 3
构建正常面板
用健康人血浆样本运行 ichorCNA 提供的 PoN 脚本，得到每个窗口的系统性偏差参考。面板中的样本应先确认自身没有明显拷贝数改变。
- 4
运行 ichorCNA
输入样本 WIG、GC、mappability 文件和 PoN，设置正常比例初值、倍性和最大拷贝数等参数。模型会在多组初值下拟合，输出按似然排序的候选解。
- 5
检查候选解
逐个样本查看全基因组拷贝数图和候选解列表。最佳解对应的分段应在整数拷贝数线上排列整齐；若信号很弱、分段杂乱，应把结果视为低于可靠检测范围。
- 6
汇总与纵向分析
整理每个样本的肿瘤分数、倍性和主要拷贝数改变，按患者和时间点作图，并与影像学或其他标志物对比，观察变化趋势是否一致。
关键参数与决策
正常比例初值（--normal）
设定模型搜索的正常 DNA 比例初值。预期肿瘤分数较低时，应加入 0.95、0.99 等高正常比例初值，否则模型可能陷入偏高肿瘤分数的局部解。
倍性与最大拷贝数
--ploidy 设定候选倍性，--maxCN 限制最大拷贝数状态。低肿瘤分数样本常建议只用二倍体、较小最大拷贝数，以减少模型把噪声拟合成高拷贝状态。
亚克隆估计
--estimateScPrevalence 和 --scStates 控制是否推断亚克隆拷贝数。肿瘤分数低时亚克隆信号几乎不可分辨，通常关闭以避免过拟合。
训练用染色体
--chrs 和 --chrTrain 指定分析与参数训练所用染色体。常见做法是训练时排除性染色体，避免性别差异影响肿瘤分数估计。
分箱大小
1 Mb 窗口在 0.1x 深度下噪声和分辨率较平衡。窗口过小则每个窗口读数太少、噪声上升；深度更高时可以缩小窗口以识别更短的改变。
常见错误
- 把低于检测下限的估计值当作真实定量：原方法学研究报告的可靠下限约在 3% 左右（经验值），更低的数值多半是噪声，不应解读为病情变化。
- 正常面板与样本来自不同建库流程：系统性覆盖偏差无法被消除，健康样本也可能显示虚假拷贝数改变，进而得到偏高的肿瘤分数。
- 只看自动选出的最佳解：纯度与倍性存在等价解，例如低分数二倍体和更高分数多倍体可能都能解释数据，需人工核对分段是否落在整数拷贝线上。
- 忽略克隆性造血或妊娠等非肿瘤来源：部分非肿瘤情况也会造成 cfDNA 拷贝数偏移，结果需要结合样本背景解读。
- 纵向比较时样本处理不一致：不同时间点更换试剂或测序平台，肿瘤分数变化可能来自技术差异，应尽量保持流程一致并用同一面板。
结果怎么看
全基因组拷贝数图
横轴为染色体位置，纵轴为校正后的 log2 比值，颜色表示拷贝数状态。真实信号表现为成片的整段升降；只有零散点状偏离、没有连续片段时，说明肿瘤分数很低或数据噪声大。
肿瘤分数与倍性汇总表
每个样本给出估计的肿瘤分数、倍性和对数似然。重点核对低分数样本是否接近检测下限，以及倍性为非二倍体的样本是否有足够证据支持。
候选解比较
ichorCNA 会列出不同初值收敛到的解。若前几个解似然接近但肿瘤分数差异很大，说明结果不唯一，应结合组织拷贝数或其他证据选择。
纵向变化曲线
按患者绘制各时间点肿瘤分数，标记治疗节点。治疗后下降再上升的趋势更值得关注；在检测下限附近的波动不宜解读为复发或缓解。
和相近方法怎么选
ichorCNA 与 ctDNA 突变检测（MRD）
ichorCNA 不需要知道肿瘤突变，成本低，但检测下限较高，适合晚期患者负荷评估。基于突变的个体化 MRD 检测灵敏度高得多，适合术后监测，但需要组织测序设计位点。
ichorCNA 与组织拷贝数分析
组织分析肿瘤含量高、深度足，可以做精细分段和 GISTIC 队列分析；血浆分析信号被稀释，主要输出肿瘤分数和大片段改变，不适合发现局部小片段扩增。
拷贝数法与片段组学方法
片段组学利用 ctDNA 片段偏短等特征，可以在拷贝数改变少的肿瘤中补充信号。也可以先按片段长度筛选短片段再运行 ichorCNA，以提高肿瘤 DNA 比例，但需报告筛选方式。
常见问题
ichorCNA 需要多少测序深度？
原方法设计用于约 0.1x 的超低深度全基因组测序，这也是它成本低的原因。深度更高可以减少每个窗口的计数噪声，并允许缩小窗口，但对肿瘤分数下限的改善有限，因为下限主要受肿瘤拷贝数改变的多少和幅度制约。
没有健康人血浆样本能不能做？
可以使用软件包自带的正常面板先运行，但它与你的建库流程可能不一致，系统偏差去除不彻底。建议至少收集一批同流程健康人或无肿瘤个体血浆构建自己的面板，结果会更稳定。
肿瘤分数为 0 是否代表体内没有肿瘤？
不能这样解读。估计值为 0 或很低只说明在本方法的灵敏度范围内没有检测到拷贝数信号，肿瘤可能拷贝数改变少、释放 ctDNA 少，或者肿瘤分数低于检测下限。
ichorCNA 可以用于全外显子或靶向测序数据吗？
ichorCNA 是围绕全基因组均匀覆盖设计的。外显子或靶向数据覆盖不均匀，通常利用其中的脱靶读段，或改用针对捕获数据设计的拷贝数工具，直接套用时需谨慎评估噪声。
为什么同一个样本多次运行结果不同？
通常是参数初值设置不同，导致模型收敛到不同候选解。应固定参数组合并记录，查看全部候选解的似然；如果多个解似然接近，说明样本信号不足以确定唯一答案。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 中提供血浆低深度 WGS 数据和样本信息后，会先确认参考基因组、分箱大小、正常面板来源和参数方案，然后完成分箱计数、ichorCNA 拟合和候选解检查。交付结果包括每个样本的全基因组拷贝数图、肿瘤分数与倍性汇总表、纵向变化图，以及可复现的运行脚本和参数记录。
我有 40 例晚期肺癌患者治疗前后的血浆 0.1x WGS BAM 和 20 例健康人血浆，想估计每个时间点的 ctDNA 肿瘤分数并画变化曲线。