DNA 基础模型 Evo 2 与序列建模
DNA 基础模型在大量基因组序列上做自监督预训练，学习碱基在上下文中的分布规律。Evo 2 是面向长上下文的 DNA 序列模型，可以对一段序列给出似然，也能逐位置输出碱基概率；把参考序列和携带变异的序列分别打分，差值就是这个变异的「序列似然变化」，可用于给编码区和非编码区变异排序。相关模型还有 Nucleotide Transformer 这类通用序列表征模型，以及 Enformer、Borzoi 这类直接预测表达和染色质信号的模型，三者目标不同。典型输入是参考基因组、区间坐标和 VCF 中的变异列表。模型给出的是序列统计层面的异常程度，不能直接等同于功能影响或临床意义。
什么时候用
- 非编码区变异缺少现成注释工具的评分，需要一个序列层面的参考指标
- 精细定位后得到一批候选变异，需要排序以决定实验验证顺序
- 评估长程上下文中的变异，例如调控区和结构变异断点附近
- 需要跨物种的通用序列表征，用于下游分类或回归任务
- 想用独立于保守性和注释数据库的证据交叉验证候选变异
不适合的情况
- 临床变异的致病性判定，应按相应分类规范综合多类证据
- 只关心蛋白编码后果的变异，常规注释工具更直接也更可解释
- 需要知道变异影响哪个基因、哪个组织的表达，这类问题应选表达预测模型
需要准备的数据
- 参考基因组
- FASTA 与配套索引，版本需与变异坐标一致（如 GRCh38），混用版本会导致坐标错位
- 变异列表
- VCF 或等效表格，含染色体、位置、参考与替代碱基；需先左对齐并规范化 indel 表示
- 区间定义
- 以变异位点为中心取上下文窗口，窗口大小按模型支持的上下文长度设定
- 校准用标注数据（可选）
- 已知致病与良性变异集合，或 MPRA 等功能实验数据，用于评估打分的区分能力
分析步骤
- 1
核对坐标与参考碱基
从参考基因组取出每个变异位置的碱基，与 VCF 的 REF 字段逐条比对。不一致说明基因组版本或坐标系统不对，必须先解决。做对的标志：全部变异的 REF 校验通过，indel 已左对齐并规范化。
- 2
构造上下文序列
以位点为中心截取等长窗口，生成参考序列和替代序列两条。窗口要足够长以包含可能的调控上下文，但不超过模型支持的长度；靠近染色体末端或装配缺口时需特殊处理。
- 3
计算序列似然
分别对两条序列前向计算，得到总的对数似然或目标位置的碱基概率。两者之差即变异评分。批量计算时固定窗口大小和填充方式，不同设置的分数不可混合比较。
- 4
建立阴性对照分布
在同一区域随机抽取若干不改变已知功能元件的变异，或打乱替代碱基，得到背景评分分布。候选变异的评分要放在这个分布里看，才能说明它有多异常。
- 5
用已知数据校准
用已知致病与良性变异计算 AUC，或与 MPRA、报告基因实验结果算相关性。区分能力接近随机时，不应把评分作为筛选依据，需换方法或缩小应用范围。
- 6
联合常规注释
把评分与基因、功能区、群体频率、保守性和染色质状态等注释合并。多类证据同向的变异优先级最高，仅有模型评分支持的变异需标注为弱证据。
- 7
输出候选与说明
交付排序表、评分分布图和背景对照，注明模型名称、上下文长度、参考基因组版本和打分定义。做对的标志：换一台机器按记录重跑，候选顺序能复现。
关键参数与决策
上下文窗口长度
窗口决定模型能看到多少调控上下文。太短会漏掉远端元件信息，太长会显著增加显存和时间，也可能引入无关区域噪声。常见做法是先固定一个长度做全批打分，再对重点候选换更长窗口做敏感性检查。
打分定义
可用整窗总似然差，也可只用变异位置的碱基对数概率差。前者能反映对周边上下文的影响，但受窗口长度影响大；后者更局部、可比性好。无论选哪种，整批要统一。
链方向
部分模型对正负链不对称。可同时对两条链打分并取平均或较极端者，减少方向带来的偏差；若只用一条链，要在报告中写明。
indel 的处理
插入删除会改变序列长度，总似然不可直接与 SNV 比较。常见做法是把 indel 与 SNV 分开排序，或用长度归一化后的指标，并在结果中分组展示。
阴性对照的取法
对照变异应匹配候选变异的区域类型、GC 含量和距基因距离。对照取自全基因组随机位置时，背景分布会偏低，使候选显得异常。
常见错误
- 参考基因组版本与变异坐标不一致：REF 碱基校验会不过或静默取到错误上下文，所有评分都失去意义。
- indel 未规范化就打分：同一变异的不同表示方式会得到不同窗口和分数，批次之间结果无法比较。
- 没有阴性对照就给阈值：序列似然差的绝对值没有通用含义，必须放在匹配的背景分布中解释。
- 把 SNV 与 indel、不同窗口长度的分数混在一张表里排序：量纲不同，排序结果主要由变异类型决定。
- 用模型评分代替临床变异分类：这类分析属于科研用途，不替代临床诊断或治疗决策，正式解读需按分类规范走。
- 忽略装配缺口和重复区：取到大段 N 或高度重复序列时，似然异常低，会产生大量假阳性候选。
结果怎么看
变异评分排序表
每行一个变异，含评分、所在基因与功能区、群体频率和注释。优先看评分位于背景分布极端且落在已知功能元件内的变异；若排名靠前的变异集中在重复区，说明序列提取环节有问题。
评分与背景分布对比图
候选变异评分叠加在对照分布上。候选明显偏离背景才有意义；两者高度重叠说明该批变异在序列层面没有突出异常，不足以支撑进一步实验。
校准曲线或 ROC
用已知致病与良性变异评估区分能力。AUC 明显高于 0.5 才说明评分在该类变异上可用；编码区表现好而非编码区接近随机是常见情况，应分区域分别报告。
位点级概率曲线
沿区间画出每个位置参考碱基的预测概率。保守的功能元件通常呈现高概率平台，边界清楚；整段曲线平坦无结构，提示该区域模型没有学到可用信号。
和相近方法怎么选
Evo 2 与 Enformer、Borzoi
Evo 2 建模的是 DNA 序列本身的似然，输出与功能表型无关，适合给变异的「序列异常度」排序；Enformer、Borzoi 直接预测表达和染色质信号，能给出组织特异的方向性变化。想知道会影响哪个基因的表达，应选后者。
序列模型评分与 CADD、保守性评分
CADD 等方法整合多种注释并用已知数据训练，非编码区覆盖成熟但依赖注释质量；序列模型只看序列，证据来源独立。两类证据一致的变异置信度更高，不一致时需逐个核查。
DNA 基础模型与常规变异注释流程
VEP、ANNOVAR 这类工具给出的是明确的后果分类和数据库匹配，是正式报告的基础；基础模型评分是补充性的连续指标，主要用于非编码区排序和缩小实验范围，不替代注释流程。
常见问题
Evo 2 能做什么、不能做什么？
它能对给定 DNA 序列给出似然和逐位置碱基概率，由此比较参考序列与携带变异的序列，得到序列层面的异常度评分，也能作为下游任务的序列表征。它不输出表达量变化、不指明受影响的基因或组织，也不给出临床意义。
DNA 大模型预测变异效应准不准？
取决于变异类型和区域。编码区和保守元件内的表现通常好于随机，远端非编码区差异较大。使用前应在自己关心的变异类型上用已知标注数据算一次 AUC，确认区分能力后再用于排序。
上下文窗口该取多长？
在模型支持范围内，窗口至少应覆盖变异所在的功能元件及其邻近区域。实际常见做法是先用一个统一长度批量打分，再对前列候选换一两个更长的窗口，看排序是否稳定；排序随窗口大幅变化说明结论不稳。
需要什么样的计算资源？
长上下文模型显存占用随窗口长度明显增加，批量打分基本需要 GPU。常见策略是先在少量变异上验证流程和参数，再按窗口长度和批大小估算总耗时，分批运行并缓存中间结果。
这类评分可以写进临床报告吗？
不建议作为独立依据。它属于科研分析指标，不替代临床诊断或治疗决策。临床变异解读应遵循既有分类规范，综合群体频率、功能实验、分离分析和已有文献证据。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 中给出参考基因组版本和变异列表后，会先核对坐标与 REF 碱基、规范化 indel，再用 Evo 2 对参考序列和替代序列做基因组序列建模与似然打分，并构造匹配的背景对照。交付变异评分排序表、评分与背景分布对比图、位点级概率曲线，以及记录模型设置的可复现脚本。
我有 300 个非编码区候选变异的 VCF（GRCh38），想用 Evo 2 打分排序，并和随机对照位点比一下