焦点扩增与 ecDNA 分析
焦点扩增是指一小段基因组被大量复制，常包含 MYC、EGFR、MYCN、CDK4、MDM2 等癌基因。扩增可能以多种结构存在：环状的染色体外 DNA（ecDNA），断裂-融合-桥（BFB）循环形成的染色体内反向重复，或较简单的线性串联扩增。ecDNA 没有着丝粒，细胞分裂时随机分配到子细胞，使扩增水平在细胞间差别很大，与肿瘤快速适应和耐药有关。只看拷贝数只能知道「扩增了多少」，要判断「以什么结构扩增」，需要结合拷贝数和结构变异断点重建扩增子。AmpliconArchitect（AA）是常用的重建工具，通常通过 AmpliconSuite-pipeline 调用，再用 AmpliconClassifier 给出扩增类型。典型数据是肿瘤的短读长全基因组测序。
什么时候用
- 判断某癌基因扩增是 ecDNA 还是染色体内扩增
- 在泛癌或单癌种 WGS 队列中统计 ecDNA 阳性比例并关联预后
- 解析扩增区内部结构，找出与癌基因共同扩增的增强子或其他基因
- 比较治疗前后扩增结构变化，研究 ecDNA 与耐药的关系
- 为细胞系或类器官挑选携带 ecDNA 的模型，再安排 FISH 验证
不适合的情况
- 只有 WES 或小 panel 数据：断点多位于非编码区，难以重建环状结构
- 研究几百 bp 级的小型环状 DNA（eccDNA），需要 Circle-seq 等专门实验与流程
- 只需队列层面反复扩增区域时，GISTIC2 等拷贝数方法更直接
需要准备的数据
- 肿瘤 WGS 比对文件
- 双端短读长 WGS 的坐标排序 BAM 及索引，参考基因组版本需与 AA 数据包一致，保留不一致配对和分裂 reads
- 拷贝数结果
- 全基因组拷贝数分段，用于挑选扩增种子；AmpliconSuite-pipeline 可调用 CNVkit 生成，也可用已有结果
- AA 参考数据包
- 包含参考基因组、可比对性和黑名单等注释，需按参考版本下载，并通过环境变量指定位置
- 样本信息
- 癌种、肿瘤纯度、样本类型（组织、细胞系、类器官），纯度低时扩增信号被稀释，判断需更谨慎
分析步骤
- 1
检查 WGS 质量
确认覆盖度、插入片段大小分布和比对率正常。重建依赖不一致配对 reads，插入片段分布过宽或文库重复率过高会削弱断点证据，应先评估再决定是否继续。
- 2
获取拷贝数
对肿瘤 WGS 计算全基因组拷贝数分段。如果拷贝数结果来自另一套流程，需确认它报告的是绝对拷贝数而不是 log2 比值，否则种子阈值会失去意义。
- 3
选取扩增种子
从拷贝数结果中筛出拷贝数高于阈值且长度足够的区域作为种子，并过滤掉低可比对性和已知易扩增的伪区域。种子过多通常提示拷贝数基线或倍性设置有误。
- 4
重建扩增子结构
AA 从种子区域出发扩展扩增区间，结合拷贝数和不一致配对 reads 构建断点图，再在图中寻找能解释拷贝数的环路和路径。每个扩增子输出断点图、环路文件和可视化图。
- 5
扩增类型分类
用 AmpliconClassifier 对每个扩增子分类，给出 ecDNA、BFB、复杂非环状、线性扩增等类型，并列出扩增子上的基因。检查同一样本中是否存在多个独立的 ecDNA。
- 6
人工复核
逐个查看高优先级扩增子的可视化图，确认环路是由高拷贝片段和有足够 reads 支持的断点组成的。只有少量 reads 支持的连接边、或环路穿过低拷贝区，都需要谨慎对待。
- 7
队列整合与验证
汇总每个样本的扩增类型和癌基因，与表达、临床分组关联。对关键结论用中期染色体 DNA FISH 验证：ecDNA 表现为染色体外的独立信号，染色体内扩增表现为集中的均匀染色区。
关键参数与决策
种子拷贝数与长度阈值
AmpliconSuite-pipeline 对种子设置了默认的拷贝数和最小长度阈值。纯度低或高倍性样本可能需要调整，调低会引入大量非焦点扩增，调高会漏掉低水平 ecDNA。
参考基因组版本
BAM 的参考版本必须与 AA 数据包一致，包括染色体命名。版本不一致时，可比对性注释和黑名单会错位，可能产生大量假断点。
高深度数据的下采样
AA 在深度较高时会下采样以控制运行时间和噪声，深度过低则断点证据不足。不同深度样本之间比较 ecDNA 检出率时，应说明深度差异。
纯度与倍性背景
低纯度样本中扩增被正常细胞稀释，测得拷贝数偏低；高倍性样本基线较高。判断是否焦点扩增时，应以样本自身倍性为参照，而不是固定看绝对值。
常见错误
- 把高拷贝数直接等同于 ecDNA：BFB 和染色体内串联扩增同样能达到很高拷贝，必须依据断点图和环路判断结构。
- 用 WES 数据尝试重建环状结构：外显子捕获缺少非编码区断点 reads，得到的环路证据不足，结论不可靠。
- 忽略低可比对性区域：着丝粒附近、片段重复区容易产生错误比对，形成看似成环的假断点，需要检查黑名单是否生效。
- 只报告 ecDNA 阳性而不报告扩增子内容：同一 ecDNA 上可能还有增强子和其他癌基因，结构解读比阳性标签更有价值。
- 用组织样本的计算结果代替实验验证：计算推断依赖断点证据，关键样本尤其是细胞模型应做中期 FISH 确认。
- 队列内深度和纯度差异大却直接比较阳性率：检出灵敏度不同，阳性率差异可能来自技术因素而不是生物学差异。
结果怎么看
扩增子结构图
上半部分是拷贝数，下方弧线表示不同方向的断点连接。看高拷贝片段是否被首尾相连的断点闭合成环；断点支持 reads 很少或连接到低拷贝区时，结构可信度较低。
环路与路径文件
列出 AA 推断的环路或路径，每条由若干片段按顺序和方向组成，并带有对应的拷贝数。拷贝数最高、覆盖癌基因的环路通常是重点，环路过于复杂时需人工复核。
扩增类型汇总表
每个扩增子的分类结果、所在区域和包含的癌基因。同一样本可有多个扩增子，各自类型可能不同；若大量样本被判为复杂非环状，应检查数据质量。
队列层面统计图
按癌种或分组展示 ecDNA、BFB 等类型的样本比例，以及常见扩增癌基因。比较组间差异时，应同时展示深度和纯度分布，排除技术偏倚。
和相近方法怎么选
AmpliconArchitect 与 GISTIC2
GISTIC2 在队列层面找反复出现的扩增区域，只用拷贝数，不关心结构；AA 针对单个样本重建扩增子结构，回答扩增以 ecDNA、BFB 还是线性方式存在。前者找区域，后者解析结构。
短读长与长读长重建
短读长 WGS 成本低、队列数据多，但复杂区域常有多种可能的拼接方式；长读长可直接跨越多个断点，环路更明确，有 CoRAL、Decoil 等专门工具。需要精确结构时可对关键样本补充长读长测序。
ecDNA 与小型 eccDNA
ecDNA 通常为 Mb 级大环，携带完整基因，在肿瘤中高拷贝扩增；eccDNA 多为几百 bp 到几 kb 的小环，在正常组织中也广泛存在，需要用环状 DNA 富集测序和 Circle-Map 等工具检测，两者不应混为一谈。
常见问题
ecDNA 和 HSR 有什么区别？
ecDNA 是独立于染色体的环状 DNA，没有着丝粒，分裂时随机分配；HSR 是扩增序列整合进染色体后形成的均匀染色区，随染色体稳定遗传。ecDNA 有时会整合形成 HSR，两者在 FISH 中表现明显不同。
AmpliconArchitect 需要什么数据？
需要肿瘤的双端短读长全基因组测序 BAM，以及与参考版本匹配的 AA 数据包。拷贝数种子可由 AmpliconSuite-pipeline 自动生成。WES 和靶向测序缺少非编码区断点，通常不适合。
AmpliconClassifier 的分类有哪些？
主要包括 ecDNA、BFB、复杂非环状和线性扩增等类型。ecDNA 指存在高拷贝环状结构；BFB 有特征性的反向折叠断点；复杂非环状含多个断点但不成环；线性扩增指结构较简单的串联扩增。
只用计算结果能确认 ecDNA 吗？
计算结果是基于断点和拷贝数的推断，可信度依赖数据质量。论文中的关键结论通常需要实验支持，常用中期染色体 DNA FISH 观察扩增信号是否位于染色体外，也可结合长读长测序。
单细胞数据能看出 ecDNA 吗？
单细胞数据无法直接重建环状结构，但 ecDNA 随机分配会使扩增区拷贝数或表达在细胞间差异极大，这种异质性可作为间接线索。确认结构仍需 WGS 重建或成像实验。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 里提供肿瘤 WGS 的 BAM 或已有拷贝数结果，说明参考基因组版本和关注的癌基因。Codar 确认方案后选取扩增种子，重建焦点扩增结构，区分 ecDNA、BFB、复杂和线性扩增，并汇总队列中各类型的比例和扩增基因。交付扩增子结构图、分类汇总表、队列统计图、报告和可复现脚本。
我有 40 例胶质母细胞瘤 WGS 的 BAM（GRCh38），帮我识别 EGFR 等焦点扩增，判断哪些是 ecDNA，并汇总各类扩增的比例和扩增基因