流式细胞数据分析：门控、质控与差异丰度
流式细胞术通过荧光标记抗体，在单细胞水平上同时测量多个表面或胞内蛋白，常用于免疫分型、细胞因子检测、增殖和凋亡分析。每次上机得到一个 FCS 文件，其中每一行是一个事件，每一列是散射光或荧光通道。分析通常分三层：先对原始数据做补偿、转换和异常事件清理，再通过一层层门控把目标细胞亚群圈出来，最后在样本层面比较各组之间的亚群比例和标志物表达强度。分析可以在 FlowJo 等图形软件中完成，也可以用 R 的 flowCore、flowWorkspace、openCyto 等工具实现可复现的批量处理。
什么时候用
- 比较疾病组与对照组外周血中 T、B、NK 等亚群比例
- 评估药物处理后活化、耗竭或增殖标志物的表达变化
- 多个批次、几十到上百个样本需要统一、可复现的门控
- 把 FlowJo 手工门控结果导入 R 做统计和绘图
- 在聚类分析前清理死细胞、双细胞和异常采集时段
不适合的情况
- 通道数很多、亚群未知的高维数据，更适合聚类为主的高维分析
- 只有一张代表性散点图、没有样本重复时，无法做组间统计推断
- 需要空间位置信息的问题，应使用成像类方法
需要准备的数据
- FCS 文件
- FCS 3.0 或 3.1 格式，每个样本一个文件；确认通道名和抗体对应关系在各批次之间一致
- 补偿对照
- 单染对照或单染微球，用于计算溢出矩阵；也可使用仪器导出并经核对的补偿矩阵
- 门控对照
- FMO 对照和同型对照，用于确定阳性边界，尤其是连续表达、没有清晰双峰的标志物
- 样本元数据
- 样本编号、分组、批次、采集日期、配对关系，统计模型需要这些信息
- FlowJo 工作区（可选）
- 已有手工门控的 .wsp 文件，可用 CytoML 等工具导入，保留门控树
分析步骤
- 1
读取与核对通道
用 flowCore 读取 FCS，核对每个文件的通道名、抗体标注、事件数和仪器设置。不同批次通道顺序或命名不一致时，应先统一，否则后续门控会错位。
- 2
补偿
用单染对照计算溢出矩阵并应用到所有样本。补偿正确时，单阳性群在溢出通道上的中位数应与阴性群接近；出现斜向拖尾或对角线形状，说明补偿不足或过度。
- 3
数据转换
荧光强度先做 logicle（双指数）或 arcsinh 转换，使阴性群集中、阳性群分开。转换参数应在同一面板的样本间保持一致，便于跨样本比较。
- 4
清理异常事件
用 flowAI、PeacoQC 等工具检测流速突变、信号漂移和采集末段异常，去除问题时段。记录每个样本被删除的事件比例，比例过高的样本应复核。
- 5
基础门控
依次用 FSC-A/SSC-A 去除碎片，用 FSC-A/FSC-H 去除双细胞，再用活死染料保留活细胞，并按 CD45 等谱系标志物圈定目标细胞。
- 6
亚群门控
按预先设计的门控树逐层划分亚群，阳性边界参照 FMO 对照设定。批量处理时用 openCyto 自动门控或同一模板，人工抽查不同组的样本以确认门位置合理。
- 7
提取统计量
导出每个样本各亚群的事件数、占父群比例和标志物中位荧光强度（MFI），整理为样本×指标表。检查目标亚群事件数是否太少，太少的比例估计不稳定。
- 8
组间比较
以样本为统计单位，比较亚群比例和 MFI。多组或有配对、批次时使用相应模型，并对大量亚群做多重检验校正。
关键参数与决策
阳性门的边界
连续表达的标志物没有明显分群，阳性门应依据 FMO 对照确定。只凭肉眼在散点图上划线，不同分析者之间结果差异很大，也难以复现。
转换参数
logicle 或 arcsinh 的线性区宽度决定阴性群的形状。参数过小会把阴性群拉成多个假峰，过大则压缩低表达群；应在同一面板内固定。
比例的分母
比例可以相对父群、活细胞或 CD45+ 细胞计算，不同分母会得到不同结论。研究前确定分母，并在图注中写清楚。
差异丰度的统计模型
亚群比例本质是计数数据，可用广义线性混合模型或 diffcyt 中基于 edgeR 的方法，同时纳入批次与配对。简单 t 检验在比例接近 0 或 1 时不够稳妥。
表达状态比较
比较某亚群内功能标志物时，常以每个样本该亚群的中位表达作为统计量，例如 diffcyt 的状态分析方法，而不是把所有细胞混在一起做检验。
常见错误
- 把每个细胞当作独立样本做检验：数万个细胞会让微小差异也显著，P 值失去意义；统计单位必须是样本或个体。
- 不同批次使用不同补偿矩阵或电压却不做核对：同一亚群的 MFI 会在批次间系统性偏移，被误认为组间差异。
- 疾病组和对照组由不同人门控或使用不同门位置：门控偏倚会直接变成组间差异，应使用统一模板或自动门控。
- 没有去除死细胞和双细胞：死细胞非特异结合抗体，双细胞形成假双阳性群，导致某些亚群比例被高估。
- 目标亚群事件数过少仍报告百分比：几十个事件得到的比例波动很大，需要报告事件数或设置最低事件数门槛。
- 对几十个亚群逐个检验后只报告显著的结果：未做多重检验校正，假阳性比例会很高。
结果怎么看
门控策略图
按顺序展示每一层门控的散点图或密度图，标注父群和门名称。读者应能据此复现分析；若某层门切在细胞群中间而非群间低谷，说明边界设定需要依据对照重新确认。
亚群比例箱线图
每个点是一个样本，按组展示某亚群比例。看组间中位数差异和组内离散程度；如果某组点按批次聚成两团，提示批次效应。
MFI 比较图
展示某亚群内功能标志物的中位荧光强度。只有在同一面板、同一仪器设置或已做标准化时，MFI 才能在样本间比较。
差异丰度结果表
列出每个亚群的效应量、P 值和校正后 P 值。优先关注效应量大且校正后显著的亚群，并回到门控图核对该亚群的门是否在不同样本间一致。
和相近方法怎么选
手工门控与自动门控
手工门控直观、便于结合经验，但耗时且受分析者主观影响；自动门控或模板门控可复现、适合大样本。常见做法是先手工确定门控树，再用自动方法批量执行并人工抽查。
常规流式与 CyTOF 高维分析
常规流式通道较少，按已知标志物门控即可；CyTOF 和光谱流式标志物多，亚群组合爆炸，更适合 FlowSOM 等聚类后再注释。两者在差异丰度统计上思路相同。
流式与 CITE-seq
流式测量的细胞数多、成本低，但每个细胞只有有限蛋白；CITE-seq 同时测转录组和数十到上百个表面蛋白，细胞数较少，适合发现新亚群和关联基因表达。
常见问题
流式数据用什么软件分析比较好？
图形化分析常用 FlowJo、FCS Express 等；需要批量、可复现处理时，R 中的 flowCore 负责读写和变换，flowWorkspace 管理门控树，openCyto 实现自动门控，CytoML 可导入 FlowJo 工作区。两种方式可以结合使用。
FMO 对照为什么重要？
多色流式中其他通道的荧光会扩散到目标通道，使阴性群变宽。FMO 对照缺少目标抗体但保留其他所有抗体，可以显示这种扩散的范围，因此是设定阳性边界最可靠的依据，尤其适合表达连续的标志物。
补偿和数据转换有什么区别？
补偿用于去除荧光染料之间的光谱溢出，是对通道之间线性关系的校正；转换是对强度做非线性缩放，让阴性和阳性群在图上都能清楚显示。正确顺序是先补偿再转换。
亚群比例的组间差异应该用什么检验？
两组独立样本可用 Wilcoxon 秩和检验或 t 检验；有配对、批次或多个因素时，建议使用广义线性混合模型或 diffcyt 等专门方法。无论哪种，都以样本为单位，并对多个亚群做多重检验校正。
不同批次的流式数据可以直接合并比较吗？
比例类指标在门控一致时相对稳健；MFI 受仪器电压、试剂批次影响大，直接合并风险较高。建议每批加入同一参照样本，或使用标准化方法，并在统计模型中加入批次项。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 中提供 FCS 文件、面板信息和样本分组后，会先确认补偿方式、转换参数和门控树设计，然后完成 FCS 读取、补偿、转换与异常事件清理，按门控策略批量提取各亚群比例和表达量，再做组间差异丰度与表达状态比较。交付门控策略图、质控记录、亚群统计表、差异结果表和可复现的分析脚本。
我有 30 份外周血流式 FCS 文件（类风湿关节炎 15 例、对照 15 例），10 色面板，想统一门控出 Treg 和耗竭 T 细胞并比较两组比例。