CyTOF 与高维流式聚类分析（FlowSOM）
质谱流式（CyTOF）用金属同位素代替荧光标记抗体，几乎没有光谱重叠，一次可以测量数十个蛋白标志物；光谱流式也能达到类似的维度。标志物一多，传统两两散点图门控就难以覆盖所有组合，因此分析思路转为无监督聚类：先用 FlowSOM 等算法把细胞分成较多的小簇，再合并成具有生物学意义的亚群，最后按标志物表达给亚群命名，并在样本层面比较亚群比例和功能标志物。CyTOF 数据在聚类之前还有专门的预处理，包括基于金属微珠的信号漂移校正、去条码，以及利用 DNA 和事件参数去除双细胞。
什么时候用
- 30 个以上标志物的免疫分型，需要发现未预设的细胞亚群
- 比较不同疾病状态或治疗组的免疫细胞组成
- 多批次 CyTOF 采集，需要校正仪器信号随时间漂移
- 条码混样实验，需要把混合采集的数据拆回单个样本
- 高维光谱流式数据的无监督聚类与可视化
不适合的情况
- 只有少数几个标志物时，手工门控更直接、更易解释
- 每个样本细胞数很少时，小亚群的聚类和比例估计不稳定
- 需要组织空间分布信息时，应使用成像质谱流式等空间方法
需要准备的数据
- FCS 文件
- 仪器导出的原始 FCS，包含金属通道、DNA 通道、事件长度和高斯参数等；保留微珠通道用于归一化
- 面板表
- 每个金属通道对应的抗体名称，以及标志物类型（用于聚类的谱系标志物或用于比较的功能标志物）
- 条码方案（如有）
- 每个样本对应的条码组合，用于去条码；需与实际混样一致
- 样本元数据
- 样本编号、分组、患者编号、采集批次；批次中如有参照样本应标明
分析步骤
- 1
微珠归一化
利用混入的金属标准微珠信号，校正同一次采集中仪器灵敏度随时间的漂移，并去除微珠事件。归一化后微珠强度随时间应基本平稳。
- 2
去条码
混样实验中按条码通道把事件分配回各样本，调整分离阈值。检查各样本分得的细胞数是否合理，未分配事件比例过高说明条码染色或阈值有问题。
- 3
去双细胞与死细胞
用 DNA 嵌入剂两个通道和事件长度或高斯参数排除双细胞与碎片，再用顺铂等活死标记去除死细胞。这一步通常仍需人工门控确认。
- 4
数据转换
对金属通道做 arcsinh 转换，CyTOF 常用 cofactor 为 5，荧光或光谱流式常用更大的值。转换后阴性群应集中在零附近，阳性群分开。
- 5
FlowSOM 聚类
选定谱系标志物作为聚类特征，用 FlowSOM 训练自组织映射，常用 10×10 网格得到 100 个小簇。随机种子需固定，以便结果可复现。
- 6
元聚类与注释
用一致性聚类把小簇合并为指定数量的元簇，再看每个元簇的标志物中位表达热图，依据经典标志物命名。必要时手动合并或拆分元簇。
- 7
降维可视化
对每个样本下采样后计算 UMAP 或 t-SNE，按元簇和关键标志物着色，检查亚群是否分离清晰、是否存在只来自单个样本或批次的岛屿。
- 8
样本层面比较
统计每个样本各亚群比例和功能标志物中位表达，以样本为单位用 diffcyt 等方法做差异丰度和状态分析，纳入批次和配对信息。
关键参数与决策
聚类所用标志物
聚类通常只用稳定表达、定义细胞身份的谱系标志物；活化、耗竭等功能标志物留作后续比较。把功能标志物放进聚类，会让同一细胞类型按状态被拆散。
元簇数量
元簇数没有唯一正确值。通常先设得略多于预期亚群数，再根据热图手动合并相同表型的簇，这种「先过度聚类再合并」的做法比一开始就设少更稳妥。
arcsinh cofactor
CyTOF 背景信号很低，常用 cofactor 5；光谱或荧光流式背景较高，常用 150 左右或按通道调整。cofactor 不当会让阴性群展宽或阳性群被压缩。
双细胞判定阈值
DNA 通道与事件长度的门控决定双细胞去除程度。门过宽会留下双细胞形成假中间态，过窄会丢失体积较大的细胞类型，需在不同样本上抽查。
批次校正
多批次时可在每批加入同一参照样本，用 CytoNorm 等方法学习并校正批次间的强度差异。校正后检查参照样本的分布是否在批次间对齐。
常见错误
- 跳过微珠归一化直接聚类：采集过程中信号逐渐下降，同一样本前后段细胞表达不同，可能被拆成两个假亚群。
- 未去除双细胞：T 细胞与单核细胞粘连形成的双阳性事件会被聚成一个看似新颖的亚群，常被误报为新细胞类型。
- 直接把 UMAP 上的距离当作生物学相似度：UMAP 主要保留局部结构，簇之间的远近和簇面积大小都不能直接解释。
- 各样本细胞数差异大却不下采样：细胞数多的样本主导聚类和可视化，少数样本中的特有亚群可能被忽略。
- 按批次分别聚类后再按名称对齐：不同批次的簇边界不一致，比较结果难以解释，应在校正后统一聚类。
- 把所有细胞合并做差异检验：细胞数巨大导致几乎所有差异都显著，统计单位应是样本。
结果怎么看
元簇表达热图
行为元簇，列为标志物，颜色是 arcsinh 后中位表达。每个元簇应有清晰的谱系标志物组合；若某簇同时高表达两类互斥谱系标志物，常提示双细胞残留。
UMAP 着色图
按元簇、样本和批次分别着色。亚群应按类型而非按样本或批次分开；某岛只由单个批次组成时，需要回到批次校正步骤。
亚群比例图
每个样本各亚群比例的堆叠柱图或分组箱线图。先看整体组成是否合理，例如外周血中 T 细胞是否为主要群体，再比较组间差异。
差异丰度与状态结果表
列出亚群或亚群-标志物组合的效应量和校正后 P 值。显著结果应回到热图和 UMAP 确认该亚群定义清晰，而不是噪声小簇。
和相近方法怎么选
FlowSOM 与 PhenoGraph
FlowSOM 速度快、可以直接处理大量细胞，结果依赖元簇数设定；PhenoGraph 基于近邻图的社区检测，自动决定簇数，但大数据时速度较慢。常以 FlowSOM 为主，PhenoGraph 用于交叉验证亚群结构。
高维聚类与手工门控
手工门控只能覆盖预设的标志物组合；聚类能发现意料之外的亚群，但需要人工注释和验证。实际常用聚类发现亚群，再用门控在新样本中确认。
CyTOF 与成像质谱流式（IMC）
两者使用相同的金属标记体系。CyTOF 测量悬浮单细胞，细胞数多、无空间信息；IMC 在组织切片上成像，可分析细胞邻域，但需要先做细胞分割，细胞数和标志物强度定量较复杂。
常见问题
CyTOF 数据分析常用哪些 R 包？
CATALYST 覆盖归一化、去条码、补偿以及基于 FlowSOM 的聚类和可视化；FlowSOM 本身也可单独使用；diffcyt 用于差异丰度和差异状态分析；CytoNorm 用于批次校正。这些包都以 flowCore 的数据结构为基础。
FlowSOM 的元簇数应该设多少？
没有统一答案，取决于面板能区分多少细胞类型。常见做法是设得比预期亚群稍多，例如二十左右，然后依据热图合并表型相同的簇。可以比较不同数量下的一致性指标，但最终仍要以标志物表达是否可解释为准。
CyTOF 需要做补偿吗？
CyTOF 没有荧光光谱重叠，但存在同位素纯度、氧化物和相邻质量通道的溢出，通常较小。面板中有强表达标志物与弱表达标志物相邻时，可以用单染微珠估计溢出矩阵，并用 CATALYST 校正。
UMAP 每个样本要用多少细胞？
UMAP 主要用于可视化，不必用全部细胞。常见做法是每个样本随机抽取相同数量的细胞，既控制计算量，又避免细胞多的样本主导图形。聚类和比例统计则应使用全部合格细胞。
高维流式聚类结果怎么验证？
可以从三方面验证：热图中标志物组合是否符合已知细胞类型；用手工门控在原始数据中复现该亚群并比较比例；更换随机种子或聚类方法后亚群是否稳定存在。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 中提供 CyTOF 或高维流式 FCS 文件和面板表后，会先确认归一化、去双细胞策略和聚类标志物方案，然后完成微珠归一化与双细胞、死细胞去除，再进行 arcsinh 转换、FlowSOM 聚类、元聚类、UMAP 可视化和亚群表型鉴定。交付表达热图、UMAP 图、亚群比例表和可复现脚本。
我有 24 份 CyTOF FCS 文件（肿瘤患者和健康人各 12 例），35 个标志物，想做微珠归一化和去双细胞，再用 FlowSOM 聚类注释免疫亚群。