RNA 速度分析（scVelo、CellRank）
RNA 速度利用同一细胞中未剪接（前体）和已剪接（成熟）mRNA 的比例，估计每个基因的表达正在上升还是下降，把所有基因汇总后得到细胞在表达空间中的移动方向。基因刚被激活时未剪接转录本相对偏多，关闭时则偏少，这一不平衡就是速度的来源。常用工具是 velocyto（生成剪接矩阵）和 scVelo（估计速度，提供稳态、随机和动力学三种模型），再用 CellRank 把速度转化为终末状态和命运概率。典型数据是 10x 等液滴平台的单细胞转录组，要求保留比对 BAM 以重新统计内含子读段。
什么时候用
- 分化数据中不确定起点和方向，需要不依赖先验标注的方向证据
- 判断一个中间态细胞群更可能流向哪一种终末命运
- 估计细胞分化的潜在时间（latent time）并找出驱动基因
- 验证伪时间分析得到的方向是否与转录动力学一致
- 研究刺激后短时间内的转录反应，如免疫细胞激活早期
不适合的情况
- 已处于稳态的成熟细胞群，表达不再变化，速度主要是噪音
- 没有 BAM 或 FASTQ、只有表达矩阵的数据，无法区分剪接状态
- 全长测序覆盖但内含子读段很少的平台，未剪接信号不足
需要准备的数据
- 剪接与未剪接矩阵
- velocyto run10x 生成的 loom，或 STARsolo 加 Velocyto 选项、alevin-fry 等的输出，需含 spliced 和 unspliced 两层。
- 比对文件与注释
- 生成矩阵需要 Cell Ranger 等产生的 BAM、细胞条码列表和与比对一致的 GTF。
- 已有的质控和注释结果
- 细胞条码、聚类、注释和降维坐标；注意 loom 与 Seurat 中条码前后缀格式常不同，需统一后合并。
- 目标谱系的细胞子集
- 建议只保留相关谱系，混入无关细胞类型会让不同动力学的基因相互干扰。
分析步骤
- 1
生成剪接矩阵
用 velocyto、STARsolo 或 alevin-fry 从 BAM 或 FASTQ 统计每个细胞每个基因的剪接和未剪接读段。完成后用 scv.pl.proportions 查看比例，液滴平台未剪接比例常见在一到两成左右，过低时速度信号会很弱。
- 2
合并元数据
把 loom 读入 AnnData，按统一后的条码与已有的聚类、注释和 UMAP 坐标合并。合并后核对细胞数，大量细胞匹配不上通常是条码格式或样本前缀问题。
- 3
过滤与标准化
scv.pp.filter_and_normalize 按共享计数过滤基因并选高变基因，教程常用 min_shared_counts = 20、n_top_genes = 2000。随后 scv.pp.moments 在近邻图上计算一阶和二阶矩，平滑稀疏计数。
- 4
估计速度
scv.tl.velocity 选择模型：stochastic 为默认，dynamical 需先运行 scv.tl.recover_dynamics 逐基因拟合完整的转录动力学。dynamical 更慢但能给出潜在时间和每个基因的拟合可信度。
- 5
构建速度图并投影
scv.tl.velocity_graph 计算细胞间转移概率，再用 velocity_embedding_stream 投影到 UMAP 画流线图。方向应与已知分化顺序大体一致，若成熟细胞流向祖细胞，需排查。
- 6
评估可信度
scv.tl.velocity_confidence 计算每个细胞速度与邻居的一致性；用 scv.pl.velocity 查看关键基因的相位图。低置信区域和拟合差的基因不应用来支持主要结论。
- 7
潜在时间与驱动基因
dynamical 模式下 scv.tl.latent_time 给出潜在时间，rank_dynamical_genes 按群列出拟合较好的动力学基因。用热图展示驱动基因随潜在时间的激活顺序。
- 8
推断命运概率
用 CellRank 把速度核与基于相似性的连接核组合，计算宏状态，识别起始和终末状态，再求每个细胞流向各终末状态的概率，并找出与命运相关的基因。
关键参数与决策
速度模型（mode）
stochastic 速度快，适合初步探索；dynamical 不假设稳态，能得到潜在时间，适合需要定量结论的分析。两种模型给出的方向明显冲突时，说明数据不满足模型假设，应谨慎下结论。
近邻数与主成分数
scv.pp.moments 中 n_neighbors 和 n_pcs 常用 30。近邻数大会让速度更平滑但抹掉小群体的细节，小则噪音大；可在两三个取值下比较流线图是否稳定。
基因过滤阈值
min_shared_counts 要求基因同时有足够的剪接和未剪接计数。测序深度低时可适当降低，但纳入的低表达基因会降低相位图拟合质量。
CellRank 核权重
速度核与连接核的权重决定方向信息和相似性信息的比例，教程常用速度核 0.8、连接核 0.2 作为起点。速度可信度低时提高连接核比例可让结果更稳。
终末状态数量
CellRank 识别宏状态时需设定数量，可结合特征值间隙和已知生物学确定。数量过多会把同一终末细胞拆成几个，过少会漏掉稀有命运。
常见错误
- 把流线图当作定量证据：二维投影会扭曲高维速度，箭头的长短和细节走向都不可靠，结论应以相位图、置信度和命运概率为依据。
- 在转录速率突变的谱系上照搬模型：已有研究报道部分谱系存在转录爆发等情况，会导致方向反转，可检查主要驱动基因的相位图是否异常。
- loom 与已有对象条码没对上就合并：部分细胞丢失或注释错配，表现为某些群速度杂乱，合并后要核对细胞数和注释分布。
- 把多个批次直接放在一起估计速度：不同批次的剪接比例可能不同，会在批次之间产生虚假方向，应分批检查比例并谨慎整合。
- 在终末分化的成熟细胞上解读方向：这些细胞处于稳态，速度接近零，流线图上的小箭头主要是噪音，不应解读为去分化。
结果怎么看
速度流线图
在 UMAP 上用流线表示细胞群的整体移动方向。看主干方向是否从祖细胞指向成熟细胞、分叉处流线是否分开。若流线在群内打转或在终末群出现逆流，结合置信度判断是否是噪音。
基因相位图
横轴为剪接、纵轴为未剪接表达，虚线或曲线是模型拟合的稳态比例。位于线上方表示基因正在被诱导，下方表示正在下调。点形成清晰的弧形才说明拟合可信。
速度置信度与潜在时间图
置信度图显示每个细胞速度与邻居一致的程度，低值区域的方向不可靠。潜在时间图以颜色表示细胞的内在时间，起点应落在祖细胞群；若与已知顺序相反，需检查模型和根细胞。
命运概率图
CellRank 为每个细胞给出流向各终末状态的概率，常以按终末状态分色的 UMAP 或圆形投影图呈现。中间态细胞的概率分布能提示命运偏向；概率在所有终末状态间平均分布说明方向信息不足。
和相近方法怎么选
稳态 / 随机模型与动力学模型
稳态和随机模型假设基因已达到转录平衡，用线性关系估计速度，计算快；动力学模型逐基因拟合诱导和抑制全过程，不依赖稳态假设，能给出潜在时间和拟合可信度，代价是耗时更长，对数据质量要求更高。
scVelo 与 CellRank
scVelo 估计每个细胞的速度和转移概率，回答细胞往哪里走；CellRank 在此基础上建模马尔可夫链，识别终末状态并计算命运概率。只要方向，用 scVelo 即可；要回答某群细胞以多大概率走向某命运，需要 CellRank。
RNA 速度与伪时间轨迹
RNA 速度从转录动力学中读取方向，不需要指定起点，但只反映短时间内的变化趋势；伪时间从整体相似性排序，能覆盖完整过程，却需要人为设定起点。可用速度确定起点和方向，再用伪时间做沿进程的基因检验。
剪接比例推断与代谢标记
剪接比例推断适用于常规单细胞数据，但依赖速率假设；4sU 等代谢标记实验直接测量新合成 RNA，速度估计更直接，需要专门的实验设计和 dynamo 等支持标记数据的工具。
常见问题
做 RNA velocity 必须要 BAM 文件吗？
需要能区分剪接状态的原始数据。常用做法是从 Cell Ranger 的 BAM 用 velocyto 统计，也可以从 FASTQ 直接用 STARsolo 或 alevin-fry 生成剪接和未剪接矩阵。只有过滤后的表达矩阵时无法补做。
scVelo 流线方向和预期相反怎么办？
先检查条码合并是否正确、未剪接比例是否过低、是否混入无关谱系；再查看主要驱动基因的相位图有无异常；换用 dynamical 模型或去掉可疑基因后重算。仍然冲突时，应如实说明速度结果与已知生物学不一致。
loom 文件和 Seurat 对象的细胞名对不上怎么处理？
velocyto 的条码通常带样本名前缀和 x 后缀，Seurat 中常为条码加 -1 后缀或样本前缀。用字符串替换统一成同一格式后再取交集合并，并核对合并后各群细胞数与原对象一致。
RNA 速度能用于 Smart-seq2 数据吗？
可以。全长测序覆盖内含子的读段，velocyto 也支持这类数据，但细胞数通常较少，近邻平滑效果有限，速度估计噪音更大。应重点看相位图质量，并结合其他证据解读方向。
latent time 和伪时间有什么不同？
latent time 由 scVelo 动力学模型推出，基于各基因共享的转录时间进程，方向来自数据本身；伪时间由细胞相似性排序，方向依赖人为设定的起点。两者可以相互印证，但都不是真实的时钟时间。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 里说明数据位置（如 Cell Ranger 输出目录或已有的 loom 与 h5ad 文件）和关心的分化谱系。Codar 会先确认方案，包括如何获得剪接与未剪接矩阵、纳入哪些细胞群、选用哪种速度模型，然后运行 RNA 速度与细胞命运推断，交付速度流线图、关键基因相位图、潜在时间和命运概率图、驱动基因表，以及分析报告和可复现脚本。
我有 10x 小鼠胰腺发育单细胞数据和 Cell Ranger 输出的 BAM，想做 RNA velocity，看内分泌前体细胞更倾向分化成哪类胰岛细胞。