自然选择信号分析（iHS、Fst、XP-EHH）
当一个有利突变在群体中快速上升频率时，它周围的序列会被一起带上来，留下可检测的「足迹」：局部多样性下降、等位基因频率谱偏向稀有或高频变异、单倍型异常延长、不同群体间分化加剧。选择信号分析就是在全基因组上扫描这些足迹，找出可能经历过正选择的区域。常用统计量分三类：基于群体分化的 Fst、XP-CLR、PBS；基于频率谱和多样性的 Tajima's D、θπ；基于扩展单倍型纯合度（EHH）的 iHS、nSL、XP-EHH。典型应用包括人群对高原、饮食、病原体的适应，以及家畜和作物的驯化与品种改良。输入通常是多个群体的全基因组 SNP 数据，单倍型类方法还需要定相数据。
什么时候用
- 比较驯化种和野生种、或不同品种的重测序数据，寻找驯化和育种选择区域
- 研究人群对高海拔、寒冷、饮食等环境的局部适应
- 在 GWAS 关注的区域，判断该位点是否同时承受了选择
- 对感兴趣基因所在区域做针对性的单倍型纯合度检验
- 为群体遗传学论文提供全基因组选择区域列表和候选基因
不适合的情况
- 每个群体只有几个样本：频率和单倍型统计量的方差太大，离群窗口大多是噪音
- 只有一个群体却想用 Fst 或 XP-EHH：这两类方法需要两个及以上群体对比
- 把离群窗口直接等同于被选择的基因：人口瓶颈和低重组区也会产生类似信号
需要准备的数据
- 多群体基因型
- VCF 或 PLINK 格式的全基因组 SNP，按群体列出样本名单；重测序数据需先做变异质控
- 定相单倍型
- iHS、nSL、XP-EHH 需要定相后的 VCF；定相质量直接影响单倍型长度估计
- 祖先等位基因
- iHS 需要区分祖先与衍生等位基因，常用近缘外群推断；无法获得时可用不区分方向的统计量
- 遗传图谱
- iHS 与 XP-EHH 以遗传距离计算单倍型长度；没有遗传图谱时用物理距离替代，需在方法中说明
分析步骤
- 1
数据质控与分群
过滤低检出率、低质量和多等位位点，剔除近亲与离群样本，用主成分和 ADMIXTURE 确认群体划分合理。混杂了大量混血个体的群体会削弱分化信号，常把它们剔除或单独处理。
- 2
定相与祖先等位基因
用 SHAPEIT、Beagle 或 Eagle 定相，检查样本是否足以支撑定相。用外群比对确定每个位点的祖先等位基因，无法判定的位点从 iHS 分析中剔除，或只使用 |iHS| 绝对值并在方法中说明。
- 3
分化类统计量
用 vcftools 的 --weir-fst-pop 加 --fst-window-size 和 --fst-window-step 计算窗口 Fst，同时用 --window-pi 计算两个群体的 θπ 并求比值。高 Fst 且目标群体 θπ 显著降低的窗口，是选择清除的典型组合。
- 4
频率谱统计量
用 vcftools 的 --TajimaD 计算窗口 Tajima's D。选择清除后局部出现大量稀有变异，D 值显著为负；平衡选择则使 D 偏正。全基因组 D 均值本身偏负时，可能是群体扩张，需要以全基因组分布为背景判断。
- 5
单倍型类统计量
用 selscan 或 R 包 rehh 计算 iHS、nSL（单群体）和 XP-EHH（两群体对比），按等位基因频率分箱标准化。iHS 对正在进行、尚未固定的清除敏感；XP-EHH 适合在一个群体中已接近固定的清除。
- 6
确定离群窗口
把 SNP 级结果汇总到窗口，取经验分布最极端的 1% 或 5% 窗口作为候选。多个方法同时离群的窗口更可信。合并相邻候选窗口为区域，统计区域长度和区域内基因。
- 7
候选基因与注释
提取候选区域内的基因，做 GO 或 KEGG 富集，查看与已知表型（体型、毛色、代谢、免疫等）相关的基因。对重点区域画单倍型热图和 EHH 衰减曲线，确认信号的形态。
关键参数与决策
窗口大小与步长
窗口取决于 LD 衰减距离和标记密度：LD 衰减快、标记密集时窗口可小，LD 延伸长的家畜可用几十到上百 kb。步长常取窗口的一半或更小。窗口内 SNP 太少的窗口应剔除，以免统计量被个别位点主导。
离群阈值
经验离群法常取前 1% 或 5% 的窗口，这只是排名，不是显著性检验。若要给出统计显著性，需要用符合群体历史的中性模拟（如 msprime、SLiM）得到零分布，再计算模拟下的经验 P 值。
|iHS| 阈值与窗口汇总
标准化后的 iHS 近似标准正态，常用 |iHS| 大于 2 作为极端位点，再计算每个窗口中极端位点的比例。单个 SNP 的高 |iHS| 不足以说明问题，成片出现才代表区域性信号。
Fst 估计方法
常用 Weir 和 Cockerham 估计量，它对样本量不等的群体做了校正。窗口 Fst 可以用加权（比值的和）或平均两种方式汇总，两种结果数值不同，比较时要统一。负值通常是抽样误差，可截为 0。
比较群体的选择
XP-EHH 和 Fst 的结果取决于对照群体。对照群体与目标群体分化时间太长，全基因组普遍高分化，信号会被淹没；太近又可能共享同一次清除。通常选择分化适中、样本充足的近缘群体。
常见错误
- 不考虑人口历史：瓶颈和奠基者效应会在全基因组随机产生高 Fst 和长单倍型，没有中性模型对照时，离群窗口中很多是假阳性。
- iHS 用错祖先等位基因：方向反转时正负号颠倒，信号可能被错误地归到另一个等位基因。
- 低重组区和着丝粒附近不加区分：重组率低本身就会产生长单倍型和低多样性，应结合重组图谱或排除这些区域。
- 群体样本量差距很大却直接比较 θπ 和 Tajima's D：样本数影响这些统计量的方差，小群体的窗口更容易落入极端值。
- 只报告单一统计量的离群窗口：不同统计量对不同阶段的选择敏感，单一方法结果稳定性差，审稿人常要求多方法交集。
- 把候选区域基因富集结果当作适应机制的结论：区域里往往有多个基因，需要功能证据或与表型关联结合。
结果怎么看
全基因组曼哈顿图
横轴为染色体位置，纵轴为窗口 Fst、|iHS| 比例或 XP-EHH，虚线标出前 1% 阈值。真实清除通常是连续多个窗口抬高形成的峰，孤立的单窗口尖峰常是窗口内 SNP 过少造成的。
Fst 与 θπ 比值联合图
横轴为 θπ 比值（对数），纵轴为 Fst，右上角或左上角的点为两种指标都极端的窗口，指示哪一个群体多样性下降。多样性同时在两个群体中下降，可能是共同选择或低重组区。
EHH 衰减曲线与单倍型图
以核心 SNP 为中心，展示携带两种等位基因的单倍型 EHH 随距离衰减的速度。被选择的等位基因 EHH 衰减明显更慢，单倍型图上表现为一大片相同的单倍型。两条曲线几乎重合则说明信号较弱。
候选区域与基因表
列出每个候选区域的坐标、各统计量的值、命中方法数和区域内基因。优先关注多方法支持、区域较长且包含与研究性状相关基因的区域；只被单一方法支持的区域可作为次级候选。
和相近方法怎么选
Fst 与 XP-EHH
两者都比较两个群体。Fst 看等位基因频率差异，对较早发生、已完成的分化敏感，不需要定相。XP-EHH 看单倍型长度差异，对较近期、在一个群体中接近固定的清除更敏感，需要定相数据。两者结合可覆盖不同时间尺度。
iHS 与 nSL
两者都在单一群体中检测未完成的清除。iHS 依赖遗传图谱，nSL 以 SNP 数衡量单倍型长度，对重组率变化更稳健，没有可靠遗传图谱的物种更适合 nSL。两者均需要定相，iHS 还需要祖先等位基因。
选择信号扫描与 GWAS
GWAS 需要表型，回答哪些位点与性状相关；选择信号扫描不需要表型，回答哪些区域在群体历史中被选择。两者交集的区域常被视为对某个性状进行选择的有力候选，但选择的具体目标性状仍需单独验证。
常见问题
Fst 多少算高？
没有绝对标准，取决于两个群体整体的分化程度。通常的做法是以全基因组窗口 Fst 的经验分布为背景，取前 1% 或 5%。全基因组平均 Fst 很高的群体对，单个窗口的高值意义有限，需要结合 θπ 比值和单倍型统计量。
iHS 正负号代表什么？
iHS 是祖先与衍生等位基因单倍型纯合度之比的对数，经标准化后，按常见定义负值表示衍生等位基因所在单倍型更长，正值表示祖先等位基因单倍型更长。不同软件的符号约定可能相反，解读前应查看所用工具的说明。很多研究使用绝对值 |iHS|。
没有祖先等位基因信息怎么办？
可以优先使用 Fst、XP-EHH 等群体比较方法，它们不依赖祖先等位基因。也可以把次等位基因当作衍生等位基因做近似，只解读 |iHS| 或 |nSL| 的绝对值，但这会在高频位点引入错误，应在方法中说明。
选择信号分析需要多少样本？
没有统一门槛。频率类统计量每个群体通常需要数十个个体才稳定，单倍型类统计量对样本量和定相质量要求更高。样本不足时应优先使用多个统计量的交集，并以模拟评估在当前样本量下统计量的波动范围。
如何区分选择信号和人口历史造成的假信号？
人口历史影响全基因组，选择只影响局部。做法是先用 dadi、SMC++ 等方法推断人口历史，再用 msprime 等工具在该历史下模拟中性数据，计算统计量的零分布。观察值超出模拟分布极端尾部的窗口才更可能是选择造成的。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 里提供多群体的 VCF 和样本分组，说明要比较的目标群体与对照群体，会先确认要用的统计量组合、窗口大小和离群阈值，然后完成质控、定相与祖先等位基因准备，计算 Fst、θπ 比值、Tajima's D、iHS 和 XP-EHH，汇总多方法交集的候选区域并注释基因。交付全基因组曼哈顿图、联合离群图、候选区域与基因表、分析报告和可复现脚本。
我有藏族和汉族各 80 人的全基因组重测序 VCF，想做选择信号扫描，用 Fst、θπ 比值和 XP-EHH 找高原适应区域，并注释候选基因