法医混合样本解析
混合样本指一份检材中含有两个以上个体的 DNA。混合 STR 图谱的每个位点可能出现多于两个等位基因，而且各贡献者的量不同，次要贡献者的峰可能低到接近噪声甚至完全消失，因此不能像单一来源样本那样直接读出基因型。现在的通行做法是概率基因型分析：把等位基因丢失、偶入、stutter 和降解写成模型，对所有可能的基因型组合加权，计算两种命题下观察到该图谱的概率之比，也就是似然比。典型输入是图谱的等位基因与峰高数据、嫌疑对象的分型、匹配人群的频率库和本实验室的验证参数。本页讲方法学，不替代有资质机构出具的鉴定意见。
什么时候用
- 检材图谱在多个位点出现三个以上等位基因，需要判断贡献者人数
- 评估某个已知个体是否可能是混合物中的贡献者，并给出似然比
- 次要贡献者占比很低、存在等位基因丢失时，需要模型化而非直接读型
- 比较不同贡献者人数假设下的解析结果，判断结论是否稳健
- 解析结果需要量化不确定度，而不是只给出包含或排除的定性判断
不适合的情况
- 图谱质量差到大量位点无分型：可用信息不足，模型给出的似然比不可解释
- 把概率基因型结果当作个体识别的唯一依据：它评估的是证据强度而非身份认定
- 直接对混合物做亲缘推断：需先在模型中同时处理混合与亲缘假设，不能分两步套用
需要准备的数据
- 混合图谱数据
- 逐位点的等位基因命名与峰高，含分析阈值以上的全部峰；需保留原始图谱以便复核溢出与拖尾
- 参考样本分型
- 嫌疑对象与已知贡献者（例如被害人）的单一来源分型，命题中要作为已知者纳入的个体必须有可靠分型
- 实验室验证参数
- 该试剂盒与仪器条件下的 stutter 比例范围、偶入率、峰高方差和降解特征，须来自本实验室验证数据
- 等位基因频率库
- 与相关人群匹配的频率数据，附样本量与罕见等位基因的最小频率处理规则
- 命题设定
- 两个相互对立的命题，各自明确贡献者人数、哪些个体为已知贡献者、未知者的人群归属与可能的亲缘关系
分析步骤
- 1
评估图谱并估人数
先核对内部大小标准与等位基因梯，剔除溢出和拖尾造成的假峰，统计可用位点数与整体峰高水平。再统计各位点等位基因数，最大值给出人数下限：三到四个至少两人，五到六个至少三人。结合峰高是否分层辅助判断，等位基因共享会使人数被低估，所以这只是下限。
- 2
用峰高推断混合比例
挑选等位基因彼此不共享的位点，按峰高把峰归入不同贡献者，估算各自占比。各位点估计值应彼此接近，若某些位点明显偏离，检查是否存在共享等位基因或丢失。比例接近一比一时高低无法分层，解析本身的不确定性显著上升，要在结论中说明。
- 3
明确命题
把两个命题写清楚：通常一方是嫌疑对象与若干未知者为贡献者，另一方是相应数量的未知者为贡献者。两个命题下的贡献者总数应一致，已知贡献者的纳入方式也要一致。若存在亲属为替代解释的可能，应把亲属关系作为对立命题单独计算一次。命题没写清时似然比没有意义。
- 4
选择模型类型
只用等位基因的出现与缺失信息的半连续模型实现简单、对参数依赖少，适合峰高信息不可靠的低质量图谱；利用峰高、stutter 和降解的连续模型信息量大、分辨力强，但需要本实验室验证得到的参数。按图谱质量选择，并在报告中说明理由与所用参数来源。
- 5
设定模型参数并求解
输入分析阈值、偶入率、stutter 模型、峰高方差和降解参数，让模型估计混合比例并对所有基因型组合加权。连续模型多依赖随机抽样求解，必须重复运行若干次并比较结果：多次运行的似然比差异应远小于结论所依赖的量级，否则说明没有收敛。
- 6
做敏感性与非贡献者检验
改变贡献者人数假设、更换频率库、调整偶入率与丢失相关参数，看似然比变化几个数量级。再用大量与案件无关的随机个体代替嫌疑对象重复计算，得到非贡献者的似然比分布。若该分布中有相当比例落在与案件结果相近的区间，说明该图谱的分辨能力不足以支持结论。
关键参数与决策
贡献者人数
最影响结果的假设。人数设少了，模型需要用大量丢失和偶入来解释多出的峰，似然比可能被人为抬高；设多了会摊薄证据强度。实践做法是在图谱支持的若干个人数值下分别计算，报告最保守的结果，并说明不同人数假设下结论是否一致。
分析阈值
决定哪些峰进入分析。阈值高则低峰被当作缺失，等位基因丢失概率上升；阈值低则噪声峰被当作等位基因，偶入率必须相应提高。阈值应由实验室用空白与稀释系列验证确定，对所有案件统一使用，不可按案件调整。
等位基因丢失与偶入参数
丢失概率在半连续模型中是显式参数，在连续模型中由峰高方差与模板量隐含决定。偶入率反映零星外源 DNA 带来的额外峰。两者都应取自本实验室验证数据而非默认值：偶入率设得过低会迫使模型用其他方式解释多余峰。
stutter 模型
连续模型需要按位点给出 stutter 相对高度的期望与波动范围。混合物中次要贡献者的真实等位基因可能与主要贡献者的 stutter 位置重合，模型必须能同时解释两种来源。stutter 参数设得过窄会把真实等位基因误判为必须由新贡献者解释。
降解参数
降解表现为峰高随片段长度增加而系统性下降。模型中引入降解斜率后，长片段位点的低峰不会被全部当成丢失。若图谱明显降解而模型未纳入该参数，长片段位点的解释会失真，似然比偏离。
常见错误
- 只按最大等位基因数定贡献者人数：等位基因共享会让多人混合在每个位点都只出现少数等位基因，人数被低估后模型用丢失来强行解释，似然比可能明显偏高。
- 命题表述不完整，没写明贡献者人数和已知贡献者：似然比是两个命题下概率的比值，命题不明确时数值无法解释，也无法被他人复核。
- 用软件默认参数而不是本实验室验证参数：stutter 比例、峰高方差和偶入率都依赖试剂盒与仪器条件，套用默认值会让模型对图谱的解释系统性偏差。
- 连续模型只跑一次就报告结果：这类模型多依赖随机抽样求解，单次运行可能未收敛，必须重复运行并确认似然比的波动远小于结论依赖的量级。
- 不做非贡献者检验：没有这条基线就无法知道该图谱对随机个体也会给出多高的似然比，低质量混合物可能对无关个体也给出偏高的值。
结果怎么看
混合比例估计
模型给出的各贡献者占比及其不确定区间。各位点独立估计应彼此接近，区间很宽说明峰高信息不足以分层。比例接近一比一时解析不确定度大，结论要相应保守；比例极度悬殊时次要贡献者接近丢失边界，结果对丢失参数非常敏感。
基因型组合权重表
按贡献者列出各候选基因型组合及其权重。权重集中在单一组合时该贡献者的分型可视为较为确定；权重分散在许多组合上时，不能报告具体分型，只能给出似然比。这张表是判断解析可靠程度的直接依据。
似然比与敏感性分析曲线
展示在不同贡献者人数、不同频率库和不同偶入率下的似然比。结论稳健时曲线在合理参数范围内波动有限且定性判断不变。若某个参数的小幅改动就使结论反转，则不应依据该图谱下结论。
非贡献者似然比分布
把大量随机无关个体代入计算得到的似然比分布。理想情况是该分布绝大部分落在支持排除的一侧，与案件结果相距明显。若分布中有可观比例接近案件所得的似然比，说明该图谱区分能力有限，结论强度必须下调。
和相近方法怎么选
半连续模型与连续模型
半连续模型只用等位基因的有无，参数少、对图谱质量要求低，但丢掉峰高信息，对次要贡献者的解析能力有限。连续模型把峰高、stutter 和降解一起建模，分辨力更高，但依赖本实验室的验证参数且需做收敛检查。图谱峰高可靠时用连续模型，低模板或峰高异常时用半连续模型更稳妥。
概率基因型与传统的包含排除判断
传统做法按等位基因是否全部出现判断包含或排除，遇到丢失只能把位点作废，无法量化证据强度，不同解析者的结论可能不一致。概率基因型把丢失、偶入和 stutter 写进模型，对基因型组合加权并输出似然比，可量化、可复核。存在丢失的混合物中，概率方法是通行做法。
毛细管电泳与测序法 STR 分型做混合解析
电泳按片段长度区分等位基因，重复数相同而序列不同的等位基因无法分开，混合物中容易出现共享等位基因。测序法能读出重复区的序列差异，把部分长度相同的等位基因分开，降低共享、提高解析能力，还能用读数比例替代峰高。代价是流程更长、参数需重新验证，目前电泳仍是常规手段。
常见问题
怎么判断混合样本有几个贡献者
先用各位点的最大等位基因数给出下限，出现三到四个至少两人、五到六个至少三人，再结合峰高是否分层和混合比例估计判断。必须明确这只是下限：贡献者之间共享等位基因会让实际人数高于观察值。实践中不定死一个人数，而是在图谱支持的几个人数假设下分别计算似然比，报告最保守的结果。
半连续模型和连续模型怎么选
看峰高信息是否可靠。图谱峰高稳定、处在验证过的范围内，用连续模型，它利用峰高、stutter 和降解信息，分辨力明显更好。图谱为低模板、峰高波动大或存在大量丢失时，峰高信息本身不可信，用只看等位基因有无的半连续模型更稳妥。无论选哪种，参数都要来自本实验室的验证数据，并在报告中写明。
为什么一定要做非贡献者检验
因为似然比的数值本身不能说明方法在这份图谱上有多大分辨力。把大量与案件无关的随机个体代入同一流程计算，得到的分布就是基线：如果其中相当比例的无关个体也能得到接近案件结果的似然比，说明该图谱区分不开贡献者与非贡献者，结论强度必须下调。这项检验既用于单个案件的解释，也用于实验室流程的整体验证。
次要贡献者占比很低还能解析吗
可以尝试但要特别谨慎。占比低意味着次要贡献者的等位基因接近或低于分析阈值，丢失概率高，模型结果对丢失和偶入参数非常敏感。此时基因型组合的权重通常很分散，不应报告具体分型，只能给出似然比，并通过敏感性分析展示结果随参数变化的范围。若非贡献者检验显示分辨力不足，结论就只能是不具备解析条件。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 的生信模式里提供混合图谱的等位基因与峰高、参考样本分型、实验室验证参数和频率库，它会确认分析方案，先统计各位点等位基因数给出贡献者人数下限、用非共享位点估计混合比例，再按选定的半连续或连续模型对基因型组合加权并计算似然比，同时做敏感性分析和非贡献者检验，交付汇总表、基因型权重表、分布图、结果说明和可复现脚本。
我有一份两到三人的混合 STR 图谱和一个嫌疑对象的分型，帮我估计贡献者人数和混合比例并算似然比