宿主-微生物互作与菌群关联分析
菌群研究找到差异菌只是第一步，更受关注的问题是这些菌如何影响宿主：它们和哪些宿主基因、代谢物、细胞因子同步变化，是否通过某个中间分子影响表型。宿主-微生物互作分析把同一批样本的菌群数据（16S 或宏基因组）与宿主侧数据（肠黏膜转录组、血清或粪便代谢组、免疫指标、宿主基因型）进行关联建模。另一类是双转录组测序，在感染模型中同时测宿主和病原的 RNA，观察两者在同一时间点的表达响应。这类分析得到的多为关联，因果需要无菌动物定植或功能实验验证。
什么时候用
- 同一批样本既有肠道菌群又有黏膜转录组，想找菌与宿主基因的对应关系
- 菌群与粪便或血清代谢组联合，寻找菌-代谢物-表型的作用链
- 细胞或动物感染模型中同时观察宿主与病原的转录响应
- 评估宿主基因型或免疫状态与特定菌丰度的关联
- 为无菌小鼠定植或体外共培养实验挑选候选菌和候选通路
不适合的情况
- 菌群和宿主数据来自不同个体：无法逐样本配对，只能做组水平比较
- 样本量很少却检验数万个菌-基因对：多重检验后几乎不可能有可靠结果
- 把相关结果直接写成某菌调控某基因：关联不含方向，混杂也可能同时影响两者
需要准备的数据
- 菌群丰度表
- ASV、物种或功能通路的计数表，附分类注释；需记录测序深度，后续做成分数据转换
- 宿主组学数据
- 同一样本的宿主转录组计数、代谢物强度或细胞因子浓度；样本 ID 必须与菌群表一一对应
- 协变量表
- 年龄、性别、BMI、用药（抗生素、质子泵抑制剂、二甲双胍等）、饮食、粪便性状，以及测序批次
- 双转录组读段
- 建议用 rRNA 去除而非 polyA 富集建库，细菌 mRNA 无 polyA 尾；需准备宿主和病原的参考与注释
分析步骤
- 1
样本配对与过滤
按样本 ID 合并菌群和宿主数据，确认每个样本两侧都有数据。去掉在大多数样本中为零的低流行菌，常见做法是保留在一定比例样本中出现的类群，以减少无意义的检验数量。
- 2
数据转换
菌群数据是成分数据，相对丰度之间存在此消彼长的约束，直接做 Pearson 相关会产生虚假相关。常用 CLR 转换（加伪计数后取对数再减去样本内均值），宿主转录组用 VST 或 log-CPM。
- 3
混杂因素评估
先分别检验用药、BMI、批次等协变量对菌群和宿主数据的解释度，例如用 PERMANOVA 看 R²。影响显著的协变量要在后续模型中校正，否则会同时驱动两侧数据，制造出关联。
- 4
整体关联检验
用 Procrustes 分析或 Mantel 检验看两套数据整体结构是否一致，判断是否值得做逐对分析。整体关联很弱时，逐对结果多半是噪音，应谨慎解读。
- 5
逐对关联建模
对菌与宿主特征做 Spearman 相关或带协变量的线性模型，如 MaAsLin2 把宿主特征作为固定效应。所有菌-特征对一起做 FDR 校正，并同时报告效应大小。
- 6
中介与通路分析
对显著的菌-代谢物-表型组合做中介分析，估计菌对表型的效应有多少经由代谢物。把与菌相关的宿主基因做富集分析，判断是否集中在免疫、屏障或代谢通路。
- 7
双转录组定量
把读段比对到宿主与病原合并的参考上，避免读段被错误分配到单一物种。两个物种的计数分别归一化和做差异分析，并检查病原读段比例是否足以支持定量。
关键参数与决策
流行率与丰度过滤
过滤过松会保留大量稀疏菌，零值主导的相关不可靠且增加多重检验负担；过严会丢掉低丰度但有生物学意义的菌。常在一定样本比例内出现的阈值下比较几种设置的结果稳定性。
相关方法
Spearman 对异常值稳健但不能校正协变量；线性模型可纳入协变量和随机效应；稀疏典型相关分析（sCCA）适合找多对多的整体对应。按研究问题选一种主方法，其余作为敏感性分析。
多重检验范围
FDR 校正应覆盖所有实际检验过的菌-特征对，而不是只对挑出的子集校正。对数万对检验，可先在类群或通路层面汇总以减少检验数。
双转录组测序深度
感染样本中病原读段往往只占很小比例，需要远高于普通转录组的总测序量才能获得足够的病原读段。建库前可用预实验估计病原 RNA 占比来确定深度。
常见错误
- 对相对丰度直接做 Pearson 相关：成分约束会使菌之间、菌与宿主特征之间出现大量虚假相关。
- 忽略抗生素和质子泵抑制剂等用药：这些药物同时改变菌群和宿主代谢，未校正时常被误判为菌对宿主的作用。
- 只报告 P 值最小的几对相关：没有全体 FDR 校正和效应大小，结果在新队列中难以复现。
- 双转录组只比对到宿主基因组：病原读段被错误比对或丢失，宿主同源基因的表达也可能被高估。
- 把横断面关联写成因果：缺少时间顺序和干预证据，至少需要纵向数据、定植实验或孟德尔随机化等补充。
结果怎么看
菌-宿主特征相关热图
行是菌，列是宿主基因或代谢物，颜色表示相关系数，星号表示 FDR 显著。成块出现的正负相关提示共同通路；如果几乎所有菌都与某一特征相关，先检查该特征是否与测序深度或批次相关。
Procrustes 分析图
两套数据的排序结果叠加，同一样本用线相连，线越短两侧结构越一致，并报告 M² 和置换检验 P 值。线条普遍很长或 P 值不显著，说明整体上菌群与宿主数据结构关联较弱。
菌-代谢物-表型网络
节点为菌、代谢物和表型，边为显著关联，颜色区分正负。关注同时连接菌和表型的代谢物节点，它们是中介分析和功能验证的优先候选。
中介分析结果表
列出每条菌-中介-表型路径的总效应、间接效应、直接效应和中介比例及置信区间。间接效应置信区间跨零时不支持中介作用；中介比例很高但总效应不显著时结果不稳定。
和相近方法怎么选
互作分析与差异丰度分析
差异丰度分析回答哪些菌在分组之间不同，只用菌群一套数据。互作分析把菌和宿主分子数据逐样本联系起来，回答差异菌可能通过什么影响宿主，通常建立在差异分析结果之上。
逐对相关与 MOFA、DIABLO 整合
逐对相关结果直观，但检验数巨大且忽略特征间的共变。MOFA、DIABLO 等多组学整合方法先提取跨组学的潜在因子或成分，再解释因子载荷，适合样本量中等、想看整体模式的研究。
观察性关联与菌群孟德尔随机化
观察性关联容易受饮食、用药等混杂影响。菌群孟德尔随机化用与菌丰度相关的宿主遗传变异作工具变量，可以部分规避混杂，但菌群相关 SNP 通常效应弱、工具变量少，结果需谨慎解读。
常见问题
菌群和代谢组怎么做关联分析？
常见流程是菌群做 CLR 转换，代谢物做对数转换和标准化，先用 Procrustes 或 Mantel 看整体一致性，再做带协变量校正的逐对 Spearman 或线性模型，统一 FDR 校正，最后对菌-代谢物-表型组合做中介分析。
16S 数据可以和宿主转录组做关联吗？
可以，通常在属水平进行，因为 16S 对种水平的分辨率有限。需要注意 16S 不提供功能信息，菌与宿主基因的关联只能提示相关类群；若要解释机制，宏基因组的功能通路丰度更有帮助。
双转录组测序和普通转录组有什么区别？
双转录组同时捕获宿主和病原的 RNA，建库通常用 rRNA 去除而非 polyA 富集，以保留细菌 mRNA。分析时把读段比对到合并参考，两个物种分别定量和归一化。病原读段占比低，所以总测序量要求更高。
关联分析结果太多怎么筛选？
先看 FDR 和效应大小，再看结果是否在不同相关方法或协变量设置下稳定，然后优先选择有生物学通路支持的组合，例如已知能产生某代谢物的菌。可用的独立队列验证比单纯提高阈值更有说服力。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 里提供配对的菌群丰度表、宿主转录组或代谢组数据及协变量后，会先确认样本配对、转换方式和需校正的混杂因素，再进行宿主与微生物互作分析：整体结构一致性检验、带协变量的逐对关联和 FDR 校正，并整理菌-宿主分子-表型的关联网络。交付相关热图、关联网络图、结果统计表、报告和可复现脚本。
我有 80 例溃疡性结肠炎患者的粪便宏基因组和配对肠黏膜 RNA-seq，想找与炎症基因表达相关的菌，并校正用药和年龄