Perturb-seq 单细胞 CRISPR 扰动分析
Perturb-seq 把 CRISPR 混池筛选和单细胞转录组测序结合在一起：每个细胞同时测到它携带的 gRNA 和全转录组，因此一次实验就能看到几十到上千个基因被敲除、敲低（CRISPRi）或激活（CRISPRa）后的完整表达变化。CROP-seq、ECCITE-seq 以及 10x Feature Barcoding 直接捕获 gRNA 都属于这一类设计。和只看细胞增殖的混池筛选相比，它回答的是「扰动这个基因后细胞状态怎么变」。典型数据是表达计数矩阵加一张 gRNA 计数矩阵，分析核心是把 gRNA 准确分配到细胞，确认扰动确实发生，再与非靶向对照比较，估计每个扰动的效应并对扰动进行归类。
什么时候用
- 一次性比较几十到上百个候选转录因子或信号通路基因敲低后的转录组变化
- 把 CRISPR 混池筛选得到的阳性基因放回单细胞层面，看它们影响的是哪些表达程序
- 按扰动后表达谱的相似度把基因归入同一复合体或同一通路
- 研究组合扰动，判断两个基因同时敲低的效应是否偏离两者相加
- 为扰动预测模型准备训练数据或独立验证集
不适合的情况
- 只关心细胞存活或增殖，没有测转录组，这类数据用混池筛选的 gRNA 计数分析即可
- 每个 gRNA 只覆盖十几个细胞，难以与对照区分小效应，结论很不稳定
- 细胞系本身高度异质且没有记录状态，扰动效应会被细胞状态差异淹没
需要准备的数据
- 基因表达计数矩阵
- Cell Ranger 等输出的原始 UMI 计数，保留 gem group 或测序通道信息，后续用于批次校正。
- gRNA 计数矩阵
- 每个细胞中每条 gRNA 的 UMI 数；CROP-seq 需从转录本中提取 gRNA 序列，需保证细胞条形码与表达矩阵一致。
- gRNA 设计表
- 列出 gRNA ID、序列、靶基因，并标出非靶向或安全靶向对照，对照数量要足以构成稳定的参照组。
- 实验元数据
- 扰动方式（KO、CRISPRi、CRISPRa）、感染 MOI、时间点、细胞系或供体，决定后续分配与统计策略。
分析步骤
- 1
常规单细胞质控
按 UMI 数、检测基因数和线粒体比例过滤细胞，去除双细胞。注意不要用过严的阈值，某些扰动本身会改变细胞大小或线粒体基因表达，过滤后会人为丢掉有效应的细胞。
- 2
gRNA 分配到细胞
对每条 gRNA 的 UMI 分布设阈值或拟合混合模型，判断细胞是否携带该 gRNA。低 MOI 实验保留单 gRNA 细胞，多 gRNA 细胞单独标记；做对的标志是单 gRNA 细胞占比与设计的 MOI 大体吻合。
- 3
检查扰动效率
对 CRISPRi 和 CRISPRa，比较每个靶基因在对应 gRNA 细胞与非靶向对照中的表达。靶基因本身表达过低时无法评估，需在结果里注明；同一基因不同 gRNA 效率差异大时考虑剔除低效 gRNA。
- 4
区分逃逸细胞
敲除实验中部分细胞携带 gRNA 但未产生功能性突变。Mixscape 先用非靶向近邻细胞扣除背景得到扰动特征，再用混合模型把细胞分为扰动成功和未扰动两类，后续效应估计只用成功细胞。
- 5
估计每个扰动的效应
以非靶向对照为参照，按 gRNA 或靶基因汇总成 pseudobulk 做差异分析，或用 SCEPTRE 等方法逐对检验 gRNA 与基因的关联。检查同一基因不同 gRNA 的差异基因方向是否一致。
- 6
扰动谱聚类与归类
把每个扰动的平均表达变化向量做相关性聚类或降维，效应相似的扰动常属于同一复合体或通路。没有显著效应的扰动应先剔除，否则会在聚类图中形成一团噪音。
- 7
细胞组成与状态分析
统计每个扰动的细胞数和在各个细胞状态簇中的比例。某扰动细胞数显著偏少可能提示影响增殖或存活，这本身就是一个表型，需要和表达变化一起报告。
关键参数与决策
gRNA 分配阈值
固定 UMI 阈值简单但对测序深度敏感；按每条 gRNA 单独拟合背景与信号的混合模型更稳。阈值过低会把环境 gRNA 污染算成真实扰动，过高会丢掉大量细胞。
单 gRNA 还是多 gRNA 细胞
低 MOI 设计通常只保留单 gRNA 细胞，结论最干净；高 MOI 设计每个细胞携带多条 gRNA，需要用 SCEPTRE 这类能处理多重扰动的关联检验，不能简单按单个 gRNA 分组比较。
对照组定义
非靶向对照最常用；切割型敲除实验中，靶向基因间区的安全靶向对照能同时控制 DNA 切割带来的损伤应答，比非靶向对照更合适。
汇总单位
按 gRNA 汇总可以检查一致性，按靶基因汇总可以提高统计功效。建议先按 gRNA 看一致性，确认后再合并到基因层面报告。
批次与通道
不同 gem group 或测序通道的细胞应在差异模型中加入通道作为协变量，或在每个通道内与该通道的对照比较，避免通道差异被误当成扰动效应。
常见错误
- 把所有携带 gRNA 的细胞都当作扰动成功：敲除实验中逃逸细胞比例可能不低，会把真实效应稀释到不显著。
- 忽略环境 gRNA 污染：裂解释放的 gRNA 会让大量细胞出现低 UMI 的假阳性信号，导致同一细胞被分配多个 gRNA。
- 逐细胞做 Wilcoxon 检验当作扰动效应：细胞数多时几乎所有基因都显著，P 值失去意义，应汇总后建模或用专门的关联方法。
- 靶基因表达几乎检测不到时仍声称「敲低成功」：低表达基因在单细胞中多为零，敲低效率需要用 bulk 或 qPCR 另外确认。
- 不检查同一基因多条 gRNA 的一致性：只有一条 gRNA 有效应时，可能是脱靶或种子序列效应，而不是靶基因功能。
结果怎么看
gRNA UMI 分布与分配统计
每条 gRNA 的 UMI 直方图应呈现背景峰和信号峰两部分。看每个细胞被分配的 gRNA 数分布，低 MOI 实验中多 gRNA 细胞占比明显偏高，通常提示阈值太低或环境污染严重。
靶基因敲低效率图
每个扰动一组，比较靶基因在扰动细胞与对照中的表达。CRISPRi 下靶基因表达应明显下降；若某基因所有 gRNA 都无变化，先排查 gRNA 设计和分配，再解读下游结果。
Mixscape 分类与 LDA 图
每个扰动中扰动成功与未扰动细胞的比例，以及 LDA 降维后各扰动的分离程度。成功细胞在 LDA 上与对照明显分开说明效应可靠；比例接近全部未扰动则说明该扰动在该细胞中几乎无转录组效应。
扰动效应热图
行是扰动，列是差异基因，颜色是相对对照的倍数变化。按行聚类后看哪些扰动形成同一模块；同一靶基因不同 gRNA 应聚在一起，否则需要怀疑脱靶。
扰动细胞数与组成图
每个扰动的细胞数柱图和在各细胞状态簇中的比例。某扰动细胞数明显少于同一文库中其他 gRNA 的预期，可能提示该基因与增殖相关；比例偏向特定簇说明扰动推动了状态转换。
和相近方法怎么选
Perturb-seq 与混池 CRISPR 筛选（MAGeCK）
混池筛选只读出 gRNA 丰度变化，规模可达全基因组，成本低，回答哪些基因影响存活或某个表型；Perturb-seq 读出全转录组，规模受细胞数限制，回答扰动后细胞状态怎么变。常见做法是先用混池筛选缩小候选，再用 Perturb-seq 解析机制。
Mixscape 与 SCEPTRE
Mixscape 适合低 MOI 敲除数据，重点是区分扰动成功与逃逸细胞并可视化；SCEPTRE 用条件重抽样检验 gRNA 与基因表达的关联，适合高 MOI 设计和需要严格控制假阳性的逐对检验。两者可以组合使用。
实测扰动与虚拟扰动预测
Perturb-seq 得到的是实测效应，是训练和评估扰动预测模型的金标准；虚拟扰动模型只能在训练数据覆盖的细胞类型和基因范围内外推，预测结果需要用实测数据验证后才能作为结论。
常见问题
Perturb-seq 每个 gRNA 需要多少个细胞？
没有统一硬门槛，取决于效应大小和想检出的基因数。强效应的转录因子扰动几十个细胞就能看出整体偏移，弱效应或想做逐基因差异需要更多细胞。建议设计时参考同类已发表数据，并用对照细胞子抽样估计在当前细胞数下的检出能力。
CRISPRi 和 CRISPR 敲除做 Perturb-seq 有什么区别？
CRISPRi 用 dCas9 融合抑制结构域降低转录，效果相对均一，可以直接在转录组中验证靶基因下降；切割型敲除依赖移码突变，部分细胞会逃逸，且靶基因 mRNA 不一定下降，因此更需要 Mixscape 这类方法识别真正扰动的细胞。
一个细胞检测到多个 gRNA 怎么办？
低 MOI 实验中多 gRNA 细胞多来自双细胞或环境污染，通常剔除；如果是有意设计的组合扰动或高 MOI 实验，则要保留并用能处理多重扰动的模型分析。先看多 gRNA 细胞的 UMI 和基因数是否偏高，可以帮助判断是否为双细胞。
扰动后没有差异基因，说明这个基因不重要吗？
不一定。可能是敲低效率不足、逃逸细胞比例高、细胞数太少，或者该基因在当前细胞类型和条件下本来不发挥作用。先确认靶基因确实下降、细胞数足够，再下「无效应」的结论，并说明结论仅限于当前细胞背景。
Perturb-seq 数据可以用 Seurat 分析吗？
可以。Seurat 提供 Mixscape 相关函数，如 CalcPerturbSig、RunMixscape 和 MixscapeLDA，适合低 MOI 敲除数据；Python 中 pertpy 也实现了 Mixscape 等扰动分析工具。逐对关联检验可以使用 SCEPTRE。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 中描述实验设计和数据位置后，会先确认扰动方式、对照 gRNA 和 MOI，再读取表达矩阵与 gRNA 计数矩阵，完成细胞质控、gRNA 分配、靶基因敲低效率检查、扰动成功细胞识别、相对对照的扰动效应估计和扰动谱聚类。交付 gRNA 分配统计、敲低效率图、扰动效应热图、差异基因表和可复现的分析脚本。
我有一份 CRISPRi Perturb-seq 数据，敲低了 60 个转录因子，带非靶向对照，帮我分配 gRNA、检查敲低效率，并按扰动效应把这些转录因子聚类。